【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 pH，于暗處振蕩溶解。3．誘變處理 吸取 MNNG溶液 lml，加入到 1m1孢子懸液中， 30℃ 振蕩 30min，立即稀釋 1000倍停止作用，然后以 102， 104兩個(gè)稀釋度分離培養(yǎng)， 30℃ 3天后計(jì)數(shù)。4．死亡率計(jì)算 將未處理的孢子液 1ml加入 1ml磷酸緩沖液中，同上逐級(jí)稀釋分離， 30℃ 下培養(yǎng) 3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計(jì)算出死亡率。5．挑取菌落進(jìn)行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選．第五節(jié) 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的選育? 營(yíng)養(yǎng)缺陷型是指通過(guò)誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分才能正常生長(zhǎng)的變異株。? 與營(yíng)養(yǎng)缺陷型對(duì)應(yīng)的是野生型 。? 能滿(mǎn)足野生型菌株正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基稱(chēng)基本培養(yǎng)基 (MM)；? 在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分的稱(chēng)補(bǔ)充培養(yǎng)基 (SM)；? 能滿(mǎn)足各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)的稱(chēng)完全培養(yǎng)基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的用途? 營(yíng)養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大。目前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類(lèi)型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術(shù)都必須有營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的步驟? 誘變? 淘汰野生型? 檢出缺陷型? 確定生長(zhǎng)譜一、誘變方法? 物理誘變? 化學(xué)誘變二、淘汰野生型? 抗生素法：野生型能在 MM中生長(zhǎng)，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在 MM中培養(yǎng)短時(shí)讓野生型生長(zhǎng)，處于活化階段，而缺陷型無(wú)法生長(zhǎng)，仍處于休眠狀態(tài)。由于細(xì)菌或酵母對(duì)一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細(xì)菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。? 菌絲過(guò)濾法：對(duì)于霉菌，因孢子生長(zhǎng)后會(huì)長(zhǎng)出菌絲體，就可用濾紙過(guò)濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過(guò)。三、檢出缺陷型? 原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)情況完全不同，缺陷型在 CM上生長(zhǎng)良好，而在 MM上則不生長(zhǎng)，野生型都能生長(zhǎng)。 ? 具體方法：影印法、點(diǎn)種法、夾層法 ? 1．將一較平皿直徑小 1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。? 2．將完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標(biāo)記方位。? 3．將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標(biāo)記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復(fù)印于上。 (一 )影印法? 4 ．將 CM和 MM在恒溫箱中培養(yǎng)。? 5．二平皿相同方位進(jìn)行比較， 即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長(zhǎng)出的菌落少于 GM平板上的。 MM上未長(zhǎng)而相應(yīng)于 CM上長(zhǎng)出的那幾個(gè)菌落就可能是缺陷型。? 此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應(yīng)有一定間隔。(二 )點(diǎn)種法? 也就是任意法。? 用接種針或牙簽將 CM上長(zhǎng)出的菌落在 MM和CM兩副平板上接種，依次在相應(yīng)位置點(diǎn)種，然后一起培養(yǎng)，觀(guān)察其生長(zhǎng)情況。? 此法結(jié)果明確，但工作量大。(三 )夾層法? 先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的 MM，凝固后再倒一薄層 MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng) 24h，將出現(xiàn)的菌落標(biāo)記，然后倒上一層 CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時(shí)第二批長(zhǎng)出的菌落就可能是缺陷型。? 此法缺點(diǎn)是，結(jié)果有時(shí)不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易 。四、營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)譜的確定? 驗(yàn)證確定是缺陷型后，就需確定其缺陷的因子，即生長(zhǎng)譜測(cè)定。生長(zhǎng)譜測(cè)定的方法? 將缺陷型菌株培養(yǎng)后，收集菌體，制備成細(xì)胞懸液，與 MM培養(yǎng)基 (融化并涼至 50℃) 混合并傾注平皿。待凝固后，分別在平皿的 5～ 6個(gè)區(qū)間放上不同的營(yíng)養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營(yíng)養(yǎng)物的濾紙圓片。培養(yǎng)后會(huì)在某組合區(qū)長(zhǎng)出，就可測(cè)得所需營(yíng)養(yǎng)。 — 個(gè)平皿測(cè)一個(gè)菌。? 以不同組合的營(yíng)養(yǎng)混合物與融化涼至 50℃ 的 MM培養(yǎng)基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線(xiàn)接種各個(gè)缺陷型菌株于各相應(yīng)位置，培養(yǎng)后根據(jù)在這些組合長(zhǎng)出可推知其營(yíng)養(yǎng)因子。在 5～ 6個(gè)平皿上可測(cè) 20株菌以上。第六節(jié) 基因育種? 基因重組育種：是運(yùn)用體外 DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，或者通過(guò)細(xì)胞間的相互作用，使一個(gè)細(xì)胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另— 個(gè)細(xì)胞的方法。一個(gè)完整的基因克隆過(guò)程包括以下步驟? １、獲得待克隆的 DNA片段（基因）；? ２、目的基因與載體在體外連接；? ３、重組 DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞；? ４、篩選、鑒定陽(yáng)性重組子；? ５、重組子的擴(kuò)增與／或表達(dá)?；蛑亟M一、質(zhì)粒的特點(diǎn)質(zhì)粒的存在并非微生物生命活動(dòng)必需。每個(gè)細(xì)胞中存在的質(zhì)粒數(shù)稱(chēng)為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。不同類(lèi)型的質(zhì)粒其拷貝數(shù)各異，同一質(zhì)粒在不同條件下，拷貝數(shù)也可能差異很大，有嚴(yán)緊型和松弛型兩種。質(zhì)粒 DNA分子常呈現(xiàn)三種形態(tài)；常見(jiàn)的一種是共價(jià)、閉環(huán)狀 DNA(CCC DNA)；其次是由于 —條鏈有缺口而產(chǎn)生的開(kāi)環(huán) DNA(ocDNA)；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產(chǎn)生的線(xiàn)性 DNA。質(zhì)粒載體二、各類(lèi)質(zhì)粒所賦予宿主細(xì)胞的不同表現(xiàn)型抗生素抗性：抗生素的產(chǎn)生；大腸桿菌素的產(chǎn)生；腸毒素的產(chǎn)生；復(fù)雜有機(jī)化合物的降解；限制性核酸內(nèi)切酶和修飾酶的產(chǎn)生；殺傷性能。在自然條件下，許多質(zhì)?？山?jīng)細(xì)菌接合或相似方式在宿主間相互轉(zhuǎn)移。在實(shí)驗(yàn)室條件下，質(zhì)粒也可經(jīng)人工手段將其轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞內(nèi)。三、質(zhì)粒 DNA的提取方法? 細(xì)菌培養(yǎng)和質(zhì)粒擴(kuò)增；? 細(xì)菌的收獲和裂解；? 質(zhì)粒 DNA的提取。四、遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化是指受體細(xì)胞直接攝取供體細(xì)胞游離的DNA片段，將其同源部分進(jìn)行堿基配對(duì)，組合到自己的基因中，從而獲得供體細(xì)胞的某些遺傳性狀。(二 )操作步驟：質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌1．從瓊脂平板上挑取新鮮菌落接入 10ml肉湯培養(yǎng)基中， 37℃ 培養(yǎng)過(guò)夜。2．取 50ml肉湯中，無(wú)菌添加 ／ LMgCl2，于 37℃ 振蕩培養(yǎng)。3．將 ／ L CaCl2溶液、試管及吸管在冰浴中冷卻。4．當(dāng)培養(yǎng)物 OD600在 ～ ，開(kāi)始收獲細(xì)胞 (大約需 2～ )．5．將培養(yǎng)物置冰浴中冷卻 10min。6．取 10ml培養(yǎng)物置 2個(gè)冷離心管中棄去上清液。7．加入 1ml ／ L CaCl2，再加 CaCl2，置冰浴中放置 20min。8． 3000r／ min離心 10min，棄去上清液．9．加入 1ml ／ L CaCl2，重新懸浮細(xì)胞，置冰浴中保存。10．加入 1～ 20μl 待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 DNA溶液。11．在冰上放置 20min，在 37℃ 處理 2min。再插入冰中．加入 37℃ 靜置培養(yǎng) 90min。12．以不同的量涂布選擇培養(yǎng)基平板。13．于 37℃ 培養(yǎng)過(guò)夜。鑒定轉(zhuǎn)化菌落。常用的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)? 自然系統(tǒng)? 人工誘導(dǎo)（完整細(xì)胞）（ 1）二價(jià)陽(yáng)離子系統(tǒng)： Ca2+， Ca2++Mg2+， Mg2+， Ca2++輔助噬菌體， Tris+Ca 2+（ 2）單價(jià)陽(yáng)離子系統(tǒng)： PEG+Li+/Cs+/Rb+（ 3）凍融系統(tǒng)（ 4） Triton處理：人工誘導(dǎo)（ PEG/原生質(zhì)體）重組 DNA中常用的工具酶? 包括限制性核酸內(nèi)切酶、 DNA連接酶、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等 .限制性?xún)?nèi)切酶? 切開(kāi) DNA分子所需的酶：每一種酶都有其各自的作用位點(diǎn)。? 常用限制性?xún)?nèi)切酶? 種類(lèi)及特性W.Arber,H.O.Smith限制性?xún)?nèi)切酶的剪切方式? 粘性未端：切開(kāi)后的兩段 DNA各留下一個(gè)尾，這 2個(gè)尾的核苷酸順序完全一樣，中是方向相反。它們之間是互補(bǔ)的，在適當(dāng)條件下可以再連接一起。其它工具酶? 連接酶T4DNA? 修補(bǔ)工具酶DNA聚合酶 I? 末端加工酶S1核酸酶 ， 堿性磷酸單脂酶? 末端轉(zhuǎn)移酶人工加 polyA或 polyT尾? 反轉(zhuǎn)錄酶載體－宿主系統(tǒng)? 載體 (vector)是攜帶外源 DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的 DNA；? 一般是通過(guò)改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等構(gòu)建的。載體應(yīng)具備以下條件：? １、能在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中復(fù)制；? ２、具有多種限制酶的單一切點(diǎn)（即所謂多克隆位點(diǎn)）以便外源 DNA插入；? ３、具有篩選標(biāo)志以區(qū)別陽(yáng)性與陰性重組分子；? ４、載體分子較小，以便體外基因操作，同時(shí)載體 DNA與宿主 DNA便于分離；? ５、對(duì)于表達(dá)型載體還應(yīng)具有與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等基因表達(dá)元件。宿主細(xì)胞必須符合以下條件? １、對(duì)載體的復(fù)制和擴(kuò)增沒(méi)有嚴(yán)格的限制；? ２、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源 DNA；? ３、在重組 DNA增殖過(guò)程中，不會(huì)對(duì)它進(jìn)行修飾；? ４、重組缺陷型，不會(huì)產(chǎn)生體內(nèi)重組；? ５、容易導(dǎo)入重組 DNA分子；? ６、符合重組 DNA操作的安全標(biāo)準(zhǔn)。目的基因的獲取? 一、通過(guò)建立基因文庫(kù)分離靶基因? 基因文庫(kù)包括兩類(lèi)：基因組文庫(kù)：利用限制性?xún)?nèi)切酶。? cDNA：用 mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈 DNA，再經(jīng) DNA聚合酶的作用產(chǎn)生雙鏈 DNA。可去除真核生物基因中不表達(dá)的內(nèi)含子。? 二、化學(xué)合成法制備 DNA片段? 從蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸順序可以知道它的遺傳密碼，再依照密碼合成基因。? 三、聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增基因片段? 對(duì)于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（ＰＣＲ），以基因組 DNA或 cDNA模板擴(kuò)增得到目的基因片段。PCR技術(shù)? 根據(jù)需擴(kuò)增片段的兩端設(shè)計(jì)引物。? 使 DNA解鏈（高溫），引物結(jié)合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開(kāi)始合成（鏈延長(zhǎng)）反應(yīng)。? 特點(diǎn)：需要很少的 DNA模板，且能直接從基因組中得到目的基因。DNA擴(kuò)增PCR反應(yīng)DNA片斷的克隆載體的條件 ：a 復(fù)制起點(diǎn) b 適宜的限制酶切點(diǎn)c 選擇標(biāo)記? DNA分子的體外連接 DNA片段的體外連接是重組 DNA技術(shù)的關(guān)鍵。DNA連接是由 DNA連接酶催化完成的。一、 DNA連接酶? DNA連接酶催化兩條雙鏈 DNA片段相鄰的 5’ 磷酸和 3’ 羥基間形成磷酸二酯鍵。? 在分子克隆中最有用的的 DNA連接酶是來(lái)自Ｔ４噬菌體的 DNA 連接酶。? T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于：? １、連接具有同源互補(bǔ)粘性末端的ＤＮＡ片段；? ２、連接雙鏈 DNA分子間的平端；? ３、在雙鏈平端的 DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。重組 DNA導(dǎo)入宿主菌? 體外連接的重組 DNA分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達(dá)。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組 DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。一、轉(zhuǎn) 化? 指以細(xì)菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過(guò)程。轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)菌必須經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)－即容易接受外源 DNA的狀態(tài)，然后利用短暫熱休克使 DNA導(dǎo)入細(xì)菌宿主中。? 此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細(xì)菌，它的優(yōu)點(diǎn)是操作