基因工程菌穩(wěn)定性分析(編輯修改稿)
2025-01-25 18:08 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 因未表達(dá) ， 減小了重組菌與質(zhì)粒丟失菌的生長速率的差別 ， 增加了質(zhì)粒穩(wěn)定性 。 ? 在培養(yǎng)基中加入 抗菌素 抑制質(zhì)粒丟失菌的生長 ，提高質(zhì)粒穩(wěn)定性 。 ? 調(diào)控環(huán)境參數(shù)如溫度 、 pH、 培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度 。 第四節(jié) 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法 ? 有些含質(zhì)粒菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒菌反應(yīng)慢 ， 間歇改變培養(yǎng)條件以改變兩種菌比生長速率 ， 可改善質(zhì)粒穩(wěn)定性 。 通過間歇供氧和改變稀釋數(shù)率 ， 都可以提高質(zhì)粒穩(wěn)定性 。 第四節(jié) 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法 2. 基因工程菌的構(gòu)建對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響 一般 , 質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性可以通過宿主菌株的謹(jǐn)慎和恰當(dāng)?shù)倪x用來消除 。 宿主菌株通常有蘇云金芽胞桿菌、 根瘤菌 、 酒精酵母和大腸桿菌等 。 例如 ， 大腸桿菌獲得外源基因的高效表達(dá)：可以選用 T PRPL、 Ptac 等 強(qiáng)啟動(dòng)子 , 通過對翻譯增強(qiáng)序列和轉(zhuǎn)錄終止序列的改進(jìn)和優(yōu)化 。 可以按照大腸桿菌系統(tǒng)偏愛的密碼子和 mRNA二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行 目的基因 的設(shè)計(jì)和合成 。 第四節(jié) 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法 3. 選擇培養(yǎng)基對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響 常用選擇性培養(yǎng)基對基因工程菌進(jìn)行培養(yǎng) ,這樣可提高帶質(zhì)粒菌的競爭力 。 一般是在質(zhì)粒上引入抗生素基因 , 再向培養(yǎng)基中加入抗生素 , 這對提高質(zhì)粒分離穩(wěn)定性非常有效 。 第四節(jié) 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法 4. 周期操作對基因工程菌質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響 一是在這種瞬變的環(huán)境中 , 重組細(xì)胞快速地適應(yīng)了該環(huán)境 , 從而降低了無質(zhì)粒細(xì)胞的相對生長優(yōu)勢 。 二則可能是在這種瞬變的環(huán)境下 , 細(xì)胞被誘導(dǎo)以保持較高的質(zhì)粒拷貝數(shù) , 而質(zhì)?？截悢?shù)的增加降低了由于隨機(jī)分配而導(dǎo)致質(zhì)粒損失的概率 。 第四節(jié) 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法 5. 固定化基因工程菌對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響 質(zhì)粒的不穩(wěn)定性對基因工程菌的培養(yǎng)和產(chǎn)物的生產(chǎn)有著極大的影響 , 將基因工程菌固定化后培養(yǎng)可提高基因工程菌的穩(wěn)定性 、 生物量和克隆基因產(chǎn)物的產(chǎn)量 。 第五節(jié) 對 NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 對成功構(gòu)建的腈水合酶 (Nitrile Hydratase, NHase) 高表達(dá)的重組大腸桿菌 BL21( DE3 )/pETNHM(Kanr)的重組質(zhì)粒 pETNHM在重組菌株中的質(zhì)粒穩(wěn)定性進(jìn)行了研究分析 。 第五節(jié) 對 NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 1. 質(zhì)粒 pETNHM的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性 質(zhì)粒 pETNHM 是將 α亞基起始密碼子突變的諾卡 氏 菌 腈 水 合 酶 基 因 插 入 商 品 化 的 pET28a(+) (Novagen公司 )質(zhì)粒載體而得到的 ， 插入位點(diǎn)為 NcoI和 BamH I 。 第五節(jié) 對 NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 第五節(jié) 對 NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 在 LB 培養(yǎng)基中對重組 BL21(DE3) /pETNHM 每隔 6h進(jìn)行反復(fù)的傳代培養(yǎng) ,約 60代后收獲細(xì)胞提取質(zhì)粒 ,并對初始構(gòu)建的質(zhì)粒和傳代培養(yǎng)后的質(zhì)粒分別以 EcoT 22I單酶切及 Nco I和 BamH I雙酶切， 然后瓊脂糖凝膠電泳 。 第五節(jié) 對 NHase重組質(zhì)粒穩(wěn)定性分析 由圖可見 ,連續(xù)傳代 60代后收獲的質(zhì)粒樣品采用 EcoT22 I單酶切及 Nco I和BamH I 雙酶切后 ,分別獲得了與初始質(zhì)粒 完 全 相 同 的 預(yù) 期 長 度 基 因 片 段(EcoT22 I單酶切 :、 ,其中 膠電泳中檢測不到 。 Nco
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