基因重組-powerpointpresentation(編輯修改稿)
2025-01-25 17:58 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ow片段。 其只具有 5’ ?3’ 聚合酶活性 3’ ?5’ 外切酶活性 35kD 76kD苦草桿菌蛋白酶裂解全酶5’ 3’外切酶 5’ 3’聚合酶 3’ 5’外切酶5’ 3’聚合酶 3’ 5’外切酶Klenow片段DNA聚合酶 I全酶應(yīng)用 DNA切口平移反應(yīng)，置備高比活 DNA探針。 (大腸桿菌 DNA聚合酶 I）DNaseIDNA聚合酶聚合酶 IdNTP32PdNTP DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記（ Klenow）2 .Taq DNA聚合酶(1)特性： ① 耐熱的 DNA聚合酶來(lái)自于嗜熱的棲熱水生菌 Thermus aquaticus 中純化而來(lái)的。 ② 5’ ?3’ 聚合酶活性 ③5’ ?3’ 外切酶活性 ④ 最佳作用溫度為 7580?C （（ 2）用途）用途①① 通過(guò)通過(guò) PCR對(duì)對(duì) DNA分子的特定序列進(jìn)行體外擴(kuò)增分子的特定序列進(jìn)行體外擴(kuò)增 ②② 對(duì)對(duì) DNA進(jìn)行測(cè)序進(jìn)行測(cè)序 （依賴(lài)于 RNA的 DNA聚合酶， RDDP）reverse transcriptase（ 1） 特性① 催化從 RNA為模板的 DNA聚合反應(yīng) ② 具 3’ ?5’ RNA外切酶活性，能特異性降解 RNA— DNA雜交分子中的 RNA部分 ③ 具 DNA指導(dǎo)的 DNA聚合酶（ DDDP） 的功能 ④ 能以 mRNA為模板催化合成出互補(bǔ)的 DNA（ cDNA） （ 2）分類(lèi) ① 禽源反轉(zhuǎn)錄酶 來(lái)自禽或骨髓細(xì)胞瘤病毒（ AMV） 具有聚合酶活性及強(qiáng)的 RNA酶 H活性 無(wú) 3’ ?5’ 外切酶活性。 溫度 42?C ② 鼠源反轉(zhuǎn)錄酶 來(lái)自 Moloney鼠白血病病毒（ MMLV）具有聚合酶活性及相對(duì)較弱的 RNA酶 H活性 無(wú) 3’ ?5’ 外切酶活性 溫度 37?C （末端轉(zhuǎn)移酶） 催化 dNTP加到 DNA分子的 3’ 羥基端3’ 末端標(biāo)記末端標(biāo)記添加多聚體尾添加多聚體尾三、 DNA連接酶： DNA Ligases are primarily responsible for joining the gaps that form in DNA during replication(., the joining of Okazaki fragments formed by discontinuous or lagging strand replication), DNA repair, and rebination. 催化雙鏈 DNA一端的3’ OH與另一雙鏈 DNA5’ 的磷酸根形成 3’ ， 5’ 磷酸二酯鍵，使具有相同粘性末端或平末端的 DNA末端連接起來(lái)。三、 DNA連接酶w 注意： DNA連接酶只能作用于雙鏈 DNA分子而不能將二個(gè)單鏈 DNA分子連接。w DNA連接酶是重要的基因重組的工具酶 應(yīng)用 DNA連接酶將具有相同粘性末端或平端的DNA分子連接起來(lái)。w DNA連接酶的特點(diǎn)：T4噬菌體 DNA連接酶和大腸桿菌 DNA連接酶T4噬菌體 DNA連接酶能連接帶粘性末端或平末端 的 DNA分子大腸桿菌 DNA連接酶不能連接平末端 DNA分子DNA重組技術(shù)常用 T4噬菌體 DNA連接酶T4噬菌體 DNA連接酶連接帶粘性末端 DNA分子的效率遠(yuǎn)高于連接平末端的 DNA分子連接反應(yīng)需要 ATP、 Mg2+和二硫蘇糖醇，最適 pH為~， ATP為連接反應(yīng)提供能量，二硫蘇糖醇可提高連接效率 ：特點(diǎn)： 催化催化 DNA 5’ 磷酸基與磷酸基與 3’ 羥基之間（切口羥基之間（切口）形成磷酸二酯鍵。）形成磷酸二酯鍵。切口切口 (nick)：： DNA分子糖分子糖 磷酸主鍵的破壞。磷酸主鍵的破壞。缺口缺口 (gap)：： DNA分子中核苷酸缺失。分子中核苷酸缺失。：分類(lèi)： T4噬菌體噬菌體 DNA連接酶連接酶 大腸桿菌大腸桿菌 DNA連接酶連接酶 ：① 連接帶匹配粘端的 DNA分子。② 使平端的雙鏈 DNA分子互相連接或與合成 接頭相連接。：（ 1）互補(bǔ)粘端 DNA(或切口間的連接 ) 5’ ACGOH pAATTCGT 3’ 3’ TGCTTAAp HOGCA 5’ ATP、 Mg2+ T4連接酶 5’ ACGAATTCGT 3’ 3’ TGCTTAAGCA 5’（ 2）平端連接5’ C G AOG pC G T A 3’3’ G C T p OHG C A T 5’ ATP
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