dna分子標記用于中藥鑒定(編輯修改稿)
2025-01-19 05:09 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 R 產(chǎn)物的產(chǎn)量。 dNTP 能與 Mg 2+ 結合，使游離的 Mg 2+ 濃度降低。 ? （ 4 ）模板 ( 靶基因 ) 質(zhì)量 是 PCR 成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的 DNA 純化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 來消化處理標本。? 再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于 PCR 反應。 ? RNA 模板提取一般采用異硫氰酸胍或酚 /SDS 法等，要防止 RNase 降解 RNA 。 ? （ 5 ） Mg 2+ 濃度： Mg 2+ 對 PCR 擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的 PCR 反應中，各種 dNTP 濃度為 200μmol/L 時， Mg 2+ 濃度為 ～ 。 ? Mg 2+ 濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增；濃度過低會降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少。 四、生藥鑒定常用的 DNA分子標記方法 ? DNA分子標記技術? ⒈ 以傳統(tǒng)的 southern雜交 為基礎的分子標記技術 RFLP限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性? ⒉ 以 PCR為基礎的分子標記技術 ⑴ RAPD 隨機擴增多態(tài)性 DNA ⑵ SCAR 測序的擴增區(qū)段 ⑶ STS 測序的標記位點 ⑷ DAF DNA擴增產(chǎn)物指紋分析? ⒊ 以 PCR和 RFLP相結合 的分子標記技術： AFLP 擴增的限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性? ⒋ 以 重復序列 為基礎的分子標記技術 ⑴ Satellite:衛(wèi)星 DNA(重復單位為幾百～幾千堿基對) ⑵ Microsatellite:微衛(wèi)星 DNA(重復單位為 2～ 5堿基對 ) ⑶ SSR：短重復序列（一）限制性片段長度多態(tài)（ restriction fragment length polymorphism ，簡稱 RFLP ） 生物在進化過程中，由于種種原因引起的基因突變和 DNA 分子結構重排，造成了分子內(nèi)核苷酸排列順序的改變，在一處或幾處發(fā)生某種差異，當這種改變（即使是很小的改變）涉及到限制性酶切位點時，酶切后產(chǎn)生的 DNA 片段長度將發(fā)生變化，即限制性酶譜的條帶方式將出現(xiàn)不同，產(chǎn)生多態(tài)性，稱為限制性片段長度多態(tài)。 ? 一般應用 Southern 雜交檢測這種多態(tài)性，將瓊脂糖凝膠中的 DNA 轉移到硝酸纖維素膜（或其它膜）上，然后再用標記的克隆基因作探針進行雜交，經(jīng)放射自顯影后即可在 X 光片上看到 DNA 多態(tài)性了。? 該方法試驗步驟繁瑣（ 包括 Southern 轉移、探針標記、雜交、檢測等 ），又受到探針來源的限制，所需 DNA 樣品量大（ 因沒有對 DNA 進行擴增 ），僅適于 DNA 未明顯降解的新鮮材料。（二）隨機擴增多態(tài)性 DNA( RAPD) （ random amplified polymorphic DNA ）和任意引物 PCR(APPCR) （ arbitrary primer PCR ） ? RAPD （ random amplified polymorphic DNA ）是 1990 年美國杜邦公司科學家 J. G. K. Williams 和加利福尼亞生物研究所 J. Welsh 領導的兩個小組幾乎同時發(fā)展起來的一項新技術。 Williams 稱之為 RAPD ， Welsh 稱之為 APPCR 。 ? RAPD 技術建立在 PCR 技術基礎上，它是以任意序列的寡核苷酸單鏈 ( 通常為 10 個堿基， APPCR 則為 20 ～ 30 個堿基 ) 為引物，對所研究的基因組 DNA
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