克隆抗體和抗體工程(編輯修改稿)
2024-10-08 20:38 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 :正常小鼠脾細(xì)胞的染色體數(shù)目為 40,而小鼠骨髓瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目的變異較大 ，可以有 62～ 68 條染色體。 2） 特性鑒定 :對單克隆抗體的親和力的鑒定是最重要的 ,一般采用酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)法。 3） 類別鑒定 :可以用相應(yīng)的抗血清及雙向免疫擴(kuò)散法進(jìn)行鑒定 。 4） 單克隆抗體的純度鑒定 :可以用有還原劑或者無還原劑條件下的 SDS PAGE 電泳進(jìn)行鑒定。 四、單克隆抗體的大量制備 （ 1）體外培養(yǎng)法可獲得 10?g/ml的抗體； （ 2）動(dòng)物體內(nèi)誘生法，可獲得 5~20mg/ml的抗體。目前多采用此法生產(chǎn)制備單克隆抗體。 優(yōu)點(diǎn)： ?操作簡便、比較經(jīng)濟(jì)、所得抗體量多、 所得單克隆抗體量較多且效價(jià)亦高， ?還可有效地保存雜交瘤細(xì)胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細(xì)胞株， 缺點(diǎn)： ?小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。 ?大量培養(yǎng)方法： ?利用懸浮培養(yǎng)方式 可增加細(xì)胞生長空間，雜交瘤細(xì)胞生長旺盛，單克隆抗體產(chǎn)量得到提高。 ?連續(xù)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度 可達(dá) ?107細(xì)胞/ml， 收集的單克隆抗體可達(dá)到 400?g/ml左右。 ?微載體懸浮培養(yǎng)法，增大單位體積的表面積，利于雜交瘤細(xì)胞生長，細(xì)胞密度可達(dá) 108細(xì)胞/ml。 并能收獲更多的單抗。 五、單克隆抗體的純化 動(dòng)物體內(nèi)誘生法制備單克隆抗體具體方法及過程 澄清和沉淀處理 ?小鼠腹水中含有紅細(xì)胞、細(xì)胞碎塊、纖維蛋白凝塊及脂質(zhì)等，應(yīng)首先用離心力 1000g離心5min， 去除殘留的小顆粒物質(zhì)； ?再用 ?m的微孔濾膜過濾，除掉污染的細(xì)菌、支原體和脂質(zhì)；用飽和硫酸銨沉淀抗體， 50%飽和硫酸銨能回收 90%以上的單克隆抗體。 分離 主要分離方法有凝膠過濾、陰離子交換層析、親和層析等。 分離 （ 1）凝膠過濾 （ 2）陰離子交換 （ 3）親和層析 第三節(jié) 基因工程抗體及其制備 (Geic engineering antibody) 基因工程抗體： 根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。 主要包括：嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價(jià)抗體和雙特異性抗體。 一、 單 克隆 抗 體靶向制劑 纖溶酶原 纖溶酶原激活劑 (tPA) 纖溶酶 血纖維蛋白原 血纖維蛋白 降解 產(chǎn)物 降解 產(chǎn)物 耦聯(lián)了 tPA的血纖維蛋白的單克隆抗體 纖溶酶原 纖溶酶 抗血纖維蛋白抗體 血塊 (1)藥物與單抗直接偶聯(lián) ?通過化學(xué)反應(yīng)在 藥物分子的氨基 和 抗體分子的羧 基之間 形成 酰胺 鍵 ,但由于 酰胺 鍵很穩(wěn)定 ,藥物與抗體分子結(jié)合后無法釋放出來 ,因此其藥用活性幾乎完全無法發(fā)揮出來。 ?用 氧化劑 把藥物分子上的糖基氧化成 羰 基 ,然后利用 羰 基與抗體分子的氨基反應(yīng)形成西佛氏堿 ,最后還原。這樣制成的靶向制劑可以保留一定的藥物活性 ,同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)證明 ,藥物顯示出一定的選擇性。 (2)藥物通過小分子與單抗連接 ? 通過一些小分子交聯(lián)劑 ,把藥物分子上的某些基團(tuán)與抗體分子上的某些基團(tuán)連接起來 。 (3)藥物通過大分子與抗體相連 ? 將較多的藥物分子接連在一種大分子聚合物上 ,然后再與單克隆抗體交聯(lián)。 二、雜交人 鼠單克隆抗體 ?鼠源單克隆抗體在臨床上的應(yīng)用前景很廣 , ?鼠源的抗體有其局限性 :被清除出人的循環(huán)系統(tǒng) 。 ?鼠源抗體一般無法有效地激發(fā)宿主的免疫防衛(wèi)系統(tǒng) , ?在大多數(shù)情況下 ,還會引發(fā)人對于鼠源抗體本身的免疫反應(yīng) , 人的抗鼠反應(yīng) (human antimouse resmse), 也就是產(chǎn)生人的抗鼠抗體 (human antimouse antibody, 簡稱 HAMA)。 Chimeric Antibodies ? Human Fc regions ? Mouse V regions 三、人源化抗體 (humanized antibody) 1. 將小鼠的 CDR序列移植到人抗體可變區(qū)框架中，產(chǎn)生的抗體稱為 CDR移植抗體。 Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人 Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人 Ab， 再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體 人源單克隆抗體 ? 化學(xué)偶聯(lián)的單抗靶向制劑產(chǎn)率很低 。 ? 偶聯(lián)分子其連接位置也是隨機(jī)的 。 ? 藥物分子的酶活性和其他生物活性部分、甚至全部喪失。 ? 嵌合抗體 的 可變區(qū) 100% 都是鼠源的 ， 對人體仍然有一定的免疫原性。 傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)是很難獲得人源單克隆抗體主要原因 : ? 人一鼠淋巴細(xì)胞的融合細(xì)胞中人源的染色體不穩(wěn)定 ,得到的人源單克隆抗體極少 。 ? 沒有 能有效代替鼠的骨髓瘤細(xì)胞的人的骨髓瘤細(xì)胞 。 ? 倫理上 ,無法對人進(jìn)行多種抗原的免疫。 獲得人源抗體的方法 I ? 先分離出正在活躍產(chǎn)生抗體的人 B 細(xì)
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