【文章內(nèi)容簡介】 使后者不經(jīng)精子穿透等有性過程即可被激活、分裂并發(fā)育 ,使得核供體的基因得到完全復(fù)制。 第 3章 細胞工程 77 ? 1938年，德國胚胎學(xué)家漢斯 斯皮曼建議用 成年的細胞核 植入卵子的辦法進行哺乳動物克隆。 ? 1952年，美國人羅伯特 ?布里格斯和 .金對豹蛙發(fā)育到 胚囊期的胚胎細胞 做移核試驗，成功地獲得了一個可以攝食的豹蛙幼體。 ? 1962年，美國的發(fā)育生物學(xué)家約翰 格登宣布他用一個 成年細胞 克隆出一只蝌蚪，從而引發(fā)了關(guān)于克隆的第一輪辯論。 ? 1984年，英國劍橋大學(xué)生物學(xué)家斯蒂恩 威拉德森用 胚胎細胞克隆 出一只羊。這是第一例得到證實的克隆哺乳動物。 2動物克隆的發(fā)展歷史 1960年代初魚類核移植工作在由中國實驗胚胎學(xué)家童第周最早開展。 第 3章 細胞工程 78 里程碑式的突破 ? 英國羅斯林（ Roslin）研究所維爾穆特 (Wilmut)博士 1997年 2月 27日在 《 Nature》 宣布用乳腺細胞的細胞核成功克隆出一只綿羊 “ 多莉 (Dolly) ” 。 維爾穆特等試驗的生物學(xué)意義是證明了哺乳動物的體細胞也具有全能性。在此之前，人們從未能從哺乳動物的已分化的體細胞再培育出基因相同的個體。但是，他們的試驗尚未解決直接從體細胞培養(yǎng)成成體的問題，他們還需借助于卵細胞，即還要依賴卵細胞的細胞質(zhì)。 第 3章 細胞工程 79 克隆“多莉”示意圖 ? 一只懷孕三個月的芬蘭多塞特母綿羊，提供了全套遺傳信息，即提供了細胞核（稱之為供體）； ? 兩只是蘇格蘭黑面母綿羊。一只提供無細胞核的卵細胞（受體）；另一只提供羊胚胎的發(fā)育環(huán)境 — 子宮，是 “ 多莉 ”羊的 “ 生 ” 母（代孕母體）。 3哺乳動物進行克隆的基本過程 * 第 3章 細胞工程 80 具體操作 ?從一只６歲芬蘭多塞特 白面母綿羊（Ａ） 的乳腺中取出乳腺細胞，將其放入低濃度的營養(yǎng)培養(yǎng)液中饑餓，細胞逐漸停止分裂進入休眠狀態(tài)而使全部基因具有活性，此細胞稱之為 “ 核供體細胞 ” ； ?注射促性腺激素 GN促使母羊（蘇格蘭 黑面母綿羊）（Ｂ） 排卵， 28～ 33h后從卵巢中取出未受精的卵細胞快速去除細胞核，放入 10%FCS（小牛血清）、1%FCS和 %FCS連續(xù) 5天，饑餓使進入 G0期做受體細胞； 第 3章 細胞工程 81 ?利用電脈沖融合方法，使供體細胞和受體細胞融合，最后形成 “ 融合細胞 ” 。電脈沖可以產(chǎn)生類似于自然受精過程中的一系列反應(yīng)，使融合細胞也能像受精卵一樣進行細胞分裂、分化，從而形成 “ 胚胎細胞 ” ； ?將胚胎細胞轉(zhuǎn)移到另一只蘇格蘭 黑面母綿羊（Ｃ） 的子宮內(nèi)，胚胎細胞進一步分化和發(fā)育，最后形成小綿羊 多莉，它具有供體母羊（ A）全套的遺傳物質(zhì)，也為白色。 第 3章 細胞工程 82 ? 成功率始終很低 ， 具有極大的偶然性和隨機性 。 277個綿羊胚胎 —— 1個多莉； ? 夭折率高 ， 不少克隆動物天生患有疾病或體形過大； ? 沒有遺傳物質(zhì)的交流和互補，將會加劇一些遺傳疾病的發(fā)生。 4存在問題 Dolly的命運： ? 2022年 2月 14日，多莉因肺部感染無法治愈而死亡， “ 享年 ” 不足 7歲。肺部感染是 1112歲的老年羊的常見病。 ? 1999年，法國全國農(nóng)業(yè)研究所的克隆牛犢出生一月后死亡。尸體解剖發(fā)現(xiàn)其脾臟、胸腺等組織未正常發(fā)育。 第 3章 細胞工程 83 1998年，美國夏威夷大學(xué) 等率先在雌性小鼠上進行了成年體細胞克隆 。 1998年，日本成功進行體細胞克隆牛。 1998年，新西蘭科學(xué)家從一頭珍稀牛克隆后代。 1999年，美國夏威夷大學(xué)從雄性小鼠尾尖取材，獲得克隆雄鼠。 2022年，楊向中博士領(lǐng)導(dǎo)的實驗室在美國從體外培養(yǎng) 613 代的細胞克隆出 6頭公牛。 2022年，美國從衰老細胞克隆出 6 頭小牛。 2022年，英國從成年動物體細胞克隆出 5 頭豬。 2022年，中國西北農(nóng)林科技大學(xué)從 4 歲山羊耳上取細胞體外培養(yǎng)，克隆出 1頭山羊。 2022年，體細胞克隆狗誕生。 2022年，體細胞克隆兔誕生。 2022年，體細胞克隆貓誕生。 2022年，體細胞克隆猴誕生。 2022年，體細胞克隆大鼠誕生。 2022年，體細胞克隆馬誕生。 第 3章 細胞工程 84 應(yīng)用價值及意義 ? 檢驗動物細胞全能性 ? 加速動物繁殖、優(yōu)良育種、保護珍貴動物。 —— 生殖性克隆 ? 克隆動物的遺傳背景相同，因此它們是模擬疾病、基因治療、器官移植等研究的良好實驗材料，具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。 ? 可以用患者本人細胞培育出新組織（器官移植）。 —— 治療性克隆 第 3章 細胞工程 85 5生殖性克隆 人體細胞克隆技術(shù) 生殖性克隆（克隆人） 治療性克?。寺∨咛ィ? 出于醫(yī)療目的而在實驗室使用克隆技術(shù)制造胚胎，然后取出胚胎干細胞進行體外培養(yǎng)以獲得再生組織或器官的過程。 “生殖性克隆”： * 指出于生殖的目的使用克隆技術(shù)在實驗室制造人類胚胎，然后將胚胎置入人類子宮發(fā)育成胎兒和嬰兒的過程?；谧鹬厝祟愖饑赖膫惱韺W(xué)考慮，目前世界各國政府嚴禁生殖性克隆。 “治療性克隆”： 第 3章 細胞工程 86 克隆人類？ ? 將普通的體細胞（男性或女性來源均可）和一枚女性卵子結(jié)合起來（儲存于女性卵子中的遺傳信息將事先被消除）。通過細胞分裂形成的胚胎應(yīng)只帶有這名供體的全部遺傳信息，最后將胚胎移植到女性子宮中，將獲得該供體人類的克隆后代。 第 3章 細胞工程 87 社會、倫理問題 ? 他（她）是正常人嗎？該如何看待他（她）？ ? 他（她）的父母是誰？ ? 誰生育了他（她）？誰愛他（她）？ ? 有可能產(chǎn)生真正相同的克隆的孿生子嗎？ Who am i？ 不管克隆技術(shù)怎樣發(fā)展，克隆人怎樣產(chǎn)生，都是人，與被克隆人實質(zhì)上是存在著年齡差的同胞胎。但就是這一點讓人們覺得很難應(yīng)對克隆人出現(xiàn)的倫理關(guān)系。 這個孩子就是人類的試驗品，這位代孕的母體起到的也僅僅是一個生育機或孵化器的作用。 第 3章 細胞工程 88 ? 英雄、偉人能夠克隆嗎？ ? 身體上任何一部分的細胞是否都可以用來克??？ ? 人可以無休止地被克隆嗎？ ? 任何克隆動物都有基因上的缺陷?？寺⊙蚝涂寺∨６加畜w形過度龐大的問題。該缺陷在克隆鼠身上也存在。克隆牛、羊、豬都存在發(fā)育不良、免疫系統(tǒng) 缺陷和心肺功能不健全的問題。那么，克隆人呢？ 第 3章 細胞工程 89 ? 克隆人是否是人類文明的倒退？ （有性生殖，無性生殖 —— 克?。? 第 3章 細胞工程 90 1998年 1月，歐洲 19個國家在法國巴黎簽署了一項有關(guān)嚴格禁止克隆人的協(xié)議。這是國際上第一個禁止克隆人的文件。它禁止各簽約國的研究機構(gòu)或個人使用任何技術(shù)創(chuàng)造與一個活人或死人基因相似的人，否則將重罰。 美國： 2022年 7月 31日，美國國會眾議院通過了一項全面禁止克隆人的法案。美國總統(tǒng)布什表示“百分之百”反對克隆人的研究，并已多次敦促參議院通過禁止克隆人的法案。 英國： 1990年通過的 《 人類授精和胚胎學(xué)法案 》 ，認為克隆人類胚胎的研究是非法的。 2022年 11月 22日英國政府公布一項新法案，明確禁止通過克隆技術(shù)復(fù)制人類個體，即“繁殖性克隆”，成為世界上第一個立法反對生殖性克隆的國家。 德國： 1991年德國實行 《 胚胎保護法 》 ，嚴格禁止人類胚胎干細胞研究以及克隆胚胎干細胞。 2022年 11月，德國衛(wèi)生部提出一項新的 《 生殖醫(yī)學(xué)法 》 草案，再次強調(diào)在德國不允許進行胚胎干細胞的培育研究。 意大利： 2022年 3月，意大利眾議院批準了政府于 1998年簽署加入歐洲禁止克隆人協(xié)議。 日本： 2022年 4月 14日，日本內(nèi)閣會議通過關(guān)于 《 限制對人的克隆技術(shù)的法律草案 》 ，禁止克隆人，違者最高將被判處 5年徒刑。 世界一些國家對克隆人研究的態(tài)度： 第 3章 細胞工程 91 ? 從需要救治的病人身上提取體細胞 ? 將該細胞的遺傳物質(zhì)置入一個去除了細胞核的卵細胞 ? 該卵細胞開始自行分裂，直至形成一個早期胚胎 ? 從這早期胚胎中提取胚胎干細胞 ? 胚胎干細胞經(jīng)過相應(yīng)的技術(shù)處理，便可發(fā)展成遺傳特征與病人完全吻合的細胞、組織或器官 ? 以前器官移植治療方法中經(jīng)常出現(xiàn)的排異反應(yīng)問題因此得到了徹底解決 ? 血細胞、腦細胞、骨骼和內(nèi)臟等都將可以更換 ? 癌癥、白血病、帕金森氏癥、心臟病等頑疾也有望得到有效的治療與治愈 ? 由于從早期人類胚胎中提取的干細胞擁有形成所有的人體細胞類型的能力，因而它也就有可能成為 21世紀最重要、最理想的人體器官替代物的原料。 6治療性克隆 * 第 3章 細胞工程 92 治療性克?。双F混合胚胎 ? 中國最早進行人獸混合胚胎實驗，現(xiàn)已中斷 ? ? 英國批準人獸雜交胚胎研究 ? ?人卵子的來源有限，無法大規(guī)模進行。 為此科學(xué)家們就考慮把人的體細胞移植到 去核的動物卵母細胞 中，讓其發(fā)育成為一個混合的異種克隆胚胎進行胚胎干細胞研究，進行“胞質(zhì)雜交”，獲得完全具有人類性狀的干細胞胚胎。由此培養(yǎng)出的胚胎干細胞可能幫助找到某些疾病的源頭，如與脊髓有關(guān)的肌肉萎縮、帕金森氏癥或阿爾茨海默氏癥等。 進行人獸混合胚胎研究的目的主要是用于治療性克隆研究。通過培育人獸混合胚胎，可以得到大量的干細胞。而干細胞可以分化成人體的各種組織和器官，在器官移植和探尋像帕金森氏癥、糖尿病等疾病的病因方面都有著廣闊的應(yīng)用前景。 第 3章 細胞工程 93 小結(jié) ? 單抗、多抗、 HAT培養(yǎng)基、治療性克隆、生殖性克隆 ? 單抗的制備方法？應(yīng)用？ ? 多利羊是如何克隆出來的？ ? 如何用體細胞克隆哺乳動物 /魚類？克隆動物有什么實際應(yīng)用？ ? 將基因工程與克隆技術(shù)兩者結(jié)合起來（即轉(zhuǎn)移的細胞核 DNA含有外源基因），能產(chǎn)生什么后果？（轉(zhuǎn)基因動物，利用克隆技術(shù)） 第 3章 細胞工程 干細胞 94 第 3章 細胞工程 95 ? 目前尚無統(tǒng)一的說法 ? 干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。 or ? 具有多項分化潛能和自我復(fù)制、更新能力的 原始未分化細胞 ，是形成各種組織器官的祖宗細胞。 * 第 3章 細胞工程 96 來源 胚胎干細胞 （ embryonic stem cells, ESC）： 指處于胚胎早期的干細胞。分化潛能寬，具有分化為機體任何組織細胞的能力，如囊胚期 (受精后 5~7天 )內(nèi)細胞團的細胞、原始生殖細胞 成體干細胞 （ adult stem cell， ASC）： 具有自我更新能力，但分化潛能窄，只能分化為相應(yīng)(或相鄰 )組織器官組成的細胞， 如： 骨髓、大腦、神經(jīng)、皮膚、胰腺、角膜、脂肪、心臟、肝臟等組織源干細胞 * 第 3章 細胞工程 97 分化潛能 單能 /專能 /偏能 /定向干細胞：只能向一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細胞分化。如上皮組織基底層的干細胞、肌肉中的成肌細胞 (衛(wèi)星細胞 )。 全能干細胞：具有形成完整個體的分化潛能。如：受精卵、 8個細胞期以前的卵裂球以及胚胎干細胞（ 后者尚有爭議） 多能干細胞（ pluripotent stem cells）：具有分化出多種細胞組織的潛能，但失去了發(fā)育成完整個體的能力，發(fā)育潛能受到一定限制。如骨髓多能造血干細胞，它可分化出至少十二種血細胞，但不能分化出造血系統(tǒng)以外的其它細胞。 * 第 3章 細胞工程 98 ? 具有自我更新能力和不同程度的多向分化潛能終生保持未分化或低分化特征，缺乏分化標記能無限地分裂、增殖，可連續(xù)分裂幾代，也可在較長時間內(nèi)保持靜止狀態(tài) * 第 3章 細胞工程 99 干細胞有 對稱 與 不對稱 兩種分裂方式 ? 不對稱分裂的結(jié)果使兩個子細胞一個成為功能專一的 分化細胞 ；另一個保持 干細胞 的特征。 對稱分裂：干細胞 分裂 干細胞 干細胞 對稱分裂：干細胞 分裂 分化細胞 分化細胞 不對稱分裂：干細胞 干細胞 分化細胞 分裂 第 3章 細胞工程 100 ? ES細胞：由 早期胚胎（囊胚期 /胚泡期） 或原始性腺中分離出來的一類細胞（前者更常用），可冷凍保存，可進行遺傳改造。 * 第 3章 細胞工程 101 獲得干細胞的四個途徑 (1)從體外培養(yǎng)的早期胚胎獲得； (2)從早期流產(chǎn)的胎兒中獲得； (3)從克隆的胚胎中獲得； (4)從成體中獲得。 第 3章 細胞工程 1．從早期胚胎獲得 ? 1998年，美國威斯康辛大學(xué) Thompson研究