westernblot,幫你理解(編輯修改稿)
2025-09-12 03:23 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 VDF膜、 NC膜、尼龍膜特點(diǎn)比較 Western Blot 的具體步驟 轉(zhuǎn)膜準(zhǔn)備 制作“三明治” Western Blot 的具體步驟 Western Blot 的具體步驟 轉(zhuǎn)膜條件： 推薦： 100V ， 1—— 2小時(shí)；根據(jù)蛋白大小以及膠厚度的不同而不同。 Western Blot 的具體步驟 ：（ 立春紅染色） 為檢測轉(zhuǎn)膜是否成功，可用相關(guān)染料對(duì)膜進(jìn)行染色。 1x立春紅 5min 染色前 染色后 Western Blot 的具體步驟 封閉條件： 4176。 C搖動(dòng)，封閉 1 hour，再用 TBST洗 5秒，進(jìn)入下一步抗體的孵育。 為防止一抗或 /和二抗與膜的非特異性結(jié)合產(chǎn)生的高背景，因此需要進(jìn)行膜的封閉，常用的封閉液： 脫脂奶粉（ 5％） BSA（ 5％） Western Blot 膜封閉液（生物試劑公司提供） 不能用于磷酸化蛋白！ Western Blot 的具體步驟 ，用 TBST稀釋抗體； ： 室溫下孵育 1～ 2h或 4℃ 過夜（一般不超過 18小時(shí)）； 3. 保持適當(dāng)?shù)膿u動(dòng)使抗體與膜的結(jié)合均勻； Western Blot 的具體步驟 擺床上，二抗雜交，室溫（ 25℃ 左右） 1h，或 4℃ 過夜。 PBST(TBST)洗滌 3次，每次 10分鐘。 上二抗 Western Blot 的具體步驟 不同二抗稀釋濃度的效果圖 Western Blot 的具體步驟 （結(jié)果檢測） 顯色方法 代表類型 特點(diǎn) 酶促底物發(fā)光法 DAB顯色法 穩(wěn)定性好，靈敏度較高（ 250pg），背景一般，成像性較差，藥品疑有一定致癌性。 化學(xué)發(fā)光法 （推薦使用） ECL發(fā)光法 穩(wěn)定性好，靈敏度高（ 1012g），背景可以很低，成像性好，且可以重復(fù)標(biāo)記， 暗室操作！ Western Blot 的具體步驟 （結(jié)果檢測） A液 B液 1 1 : 膜 混合 ECL工作液 Western Blot一般流程 ? 蛋白樣品的制備 ? SDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳 ?轉(zhuǎn)膜 ?封閉 ?一抗雜交 ?二抗雜交 ?底物顯色 Western Blot 操作步驟 ?（一） 蛋白樣品制備 ? （二） 蛋白含量的測定 Western Blot （三） SDS－ PAGE 電泳 ?1） 清洗玻璃板： ? 一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。 Western Blot （ 2 ） 灌膠與上樣 ? 玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠。） Western Blot ? 按前面方法配 10％分離膠，加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)， 可用 10ml 槍吸取 5ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。 然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開始可快一些，膠快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。）
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