第三章細(xì)胞破碎(編輯修改稿)
2025-09-12 00:14 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 蕩易引起溫度的劇烈上升 ， 操作時常在冷卻條件下進(jìn)行 。 小規(guī)模實(shí)驗常采用間歇操作 ，大規(guī)模生產(chǎn)受限制 。 ? 超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)失活 ， 因而有一定的局限性 。 超聲波破碎時，影響生物產(chǎn)品收率的因素： 溫度上升 ? 當(dāng)氣泡破裂時，絕大部分釋放出來的能都以熱的形式為液體所吸收，為了避免高溫，懸浮液應(yīng)預(yù)先冷卻到 0－ 5℃ ，并且還應(yīng)用冷卻液連續(xù)通入容器夾套，即短期的聲波破碎與短期的冷卻交替操作， 聲波破碎 /冷卻的時間比率稱為 “負(fù)載因素”。 化學(xué)效應(yīng) ? 超聲處理會引起諸如生成 游離基 這樣的化學(xué)效應(yīng)，它可能對某些需要的分子帶來破壞性影響，但對破碎細(xì)胞毫無影響。 ? 可通過添加 游離基清除劑 如胱氨酸或谷胱甘肽，或者用氫氣預(yù)吹細(xì)胞懸浮液來緩和。 連續(xù)超聲波破碎的實(shí)驗室裝置 ? 由一個帶夾套的燒杯組成 ， 其形狀和尺寸會影響懸浮液的流體動力學(xué) 。 對于剛性細(xì)胞可以添加細(xì)小的珠粒 ， 產(chǎn)生輔助的研磨效應(yīng) 。 超聲波反應(yīng)器內(nèi) ， 有四根內(nèi)環(huán)管 ， 由于聲波振蕩能量會泵送懸浮液循環(huán) ， 用插入進(jìn)出口管到內(nèi)部燒杯去的方法 ，就可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作 。 影響超聲波破碎效率的參數(shù) : (1)、振幅 ? 振幅直接與聲能有關(guān)，影響蛋白質(zhì)釋放的比速度 k。 (2)、細(xì)胞懸浮液的粘度 ? 粘度影響能耗并會抑制空穴現(xiàn)象。 (3)、表面張力 ? 添加表面活性劑或從細(xì)胞中釋放出表面活性物質(zhì)(如蛋白質(zhì) )，能顯著地影響聲波破碎效率。 ? 因為強(qiáng)烈起泡在氣一液界面上會促使蛋白質(zhì)變性和空穴清除，特別是應(yīng)用高的功率時。 (4)、被處理懸浮液的體積 ? 大體積需要高的聲能引起強(qiáng)烈渦流和大氣泡形成。 (5)、珠粒的體積和直徑 ? 添加細(xì)小的珠粒，玻璃或者鋼制的，不僅對空穴的形成有幫助，而且產(chǎn)生輔助 “研磨”效應(yīng)，從而提高破碎效率。 ? 在相同珠粒填充密度下，隨著珠粒直徑的變化， k存在最大值。 (6)、探頭的形狀和材料 ? 對于一個能級恒定的功率，探頭的振幅與其面積成反比，然而對于小直徑的探頭，聲能限制在較小的區(qū)域并且效率低。特別是當(dāng)懸浮液的體積小的時候，能量在探頭嘴附近被懸浮液吸收，強(qiáng)烈的渦流會變小。對于大的探頭，聲能消耗在大范圍上，結(jié)果則使振幅更小。 ? 探頭嘴通常用 鈦 制造 ， 因為鈦具有良好的聲學(xué)和機(jī)械特性以及對生物活性產(chǎn)物的低毒性 。 為了維修和替換 ， 通常探頭可以拆卸 。 除鈦以外 ， 還可使用其他材料如 不銹鋼或硬質(zhì)鋼 ， 但是其聲學(xué)和機(jī)械特性都不如鈦 ， 破碎速度也大幅度降低 。 ? (7)、 細(xì)胞懸浮液的流速 ? 在連續(xù)操作中 ， 流速取決于細(xì)胞在反應(yīng)器中的停留時間 ， 并影響破碎的總收率 。 ? 超聲波破碎在實(shí)驗室廣泛應(yīng)用 ， 但在工業(yè)范圍中還未采用這種方法 ， 因為要向大量細(xì)胞懸浮液中通入足夠的能量是很困難的 。 Xpress法 ? 將濃縮的菌體懸浮液冷卻至－ 25℃ 至－ 30℃ 形成冰晶體 ， 利用 500MPa以上的高壓沖擊 ， 冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出 。 細(xì)胞破碎是由于冰晶體的磨損 ， 包埋在冰中的微生物的變形所引起的 。 ? 此法稱為 X— Press法或 Hughes press法 ， 主要用于實(shí)驗室中 。 ? 影響因素： 高濃度的細(xì)胞 、 低溫 、 高的平均壓力能促進(jìn)破碎 。 ? 優(yōu)缺點(diǎn)： 適用范圍廣 ， 破碎率高 ， 細(xì)胞碎片的粉碎程度低 、活性保留率高 ， 但是 ， 該法對冷凍 — 融解敏感的生化物質(zhì)不適用 。 酶溶法 —— 研究較廣的一種方法 ? 原理：利用酶反應(yīng) ， 分解破壞細(xì)胞壁上的特殊鍵 ，從而達(dá)到破壁的目的 。 ? 自溶法 —— 控制一定條件 ， 誘發(fā)細(xì)胞自溶酶使細(xì)胞破碎 。 自溶法常采用加熱法或干燥法 。 ? 外加酶法 —— 根據(jù)細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)及組成選擇合適的酶 。 ? 細(xì)菌大多用溶菌酶 (lysozyme) ? 酵母菌常用溶酶有： β1,3葡聚糖酶 (glucanase)、β1,6葡聚糖酶 、 蛋白酶 (protease)、 甘露糖酶 (mannanase)、 糖苷酶 (glycosidase)、 肽鍵內(nèi)切酶 (endopeptidase)、 殼多糖酶等 。 細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物 ? G+ 溶菌酶、適量抑制劑 ? G 溶菌酶、 EDTA ? 放線菌 溶菌酶 ? 酵母菌 β葡聚糖酶 ? 霉菌 幾丁質(zhì)酶、 ? 植物 纖維素酶、半纖維素酶 酶溶法的特點(diǎn)（外加酶） ： ? （ 1） 酶溶法需要特定的反應(yīng)條件 。 ? （ 2） 酶具有高度專一性 ， 必須根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿富蛉苊赶到y(tǒng) ， 并確定相應(yīng)的次序 。 ? （ 3） 酶溶法的優(yōu)點(diǎn)是：具有選擇性釋放產(chǎn)物 ， 條件溫和 ， 核酸泄出量少 ， 細(xì)胞外形完整 。 ? （ 4） 酶溶法的不足： ? 溶酶價格高； ? 酶溶法通用性差 ， 且不易確定最佳的溶解條件； ? 存在產(chǎn)物抑制 ， 在溶酶系統(tǒng)中 ， 甘露糖對蛋白酶有抑制作用 。 自溶法（ Autolysis） ?誘發(fā)微
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