第8章-標記(編輯修改稿)
2024-09-11 23:09 本頁面
【文章內容簡介】 六核苷酸所有隨機組合有 4096種 2022/8/27 海南大學農學院 wss28 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 加入 DNA聚合酶 dNTPs 其中一個是標記的 dNTP 2022/8/27 海南大學農學院 wss29 [32P] dATP 通常用作放射性標記的探針。 放射自顯影檢測。 地高辛 (DIG)dUTP通常用作非放射性標記的探針。用酶聯(lián)抗地高辛抗體檢測。 變性 2022/8/27 海南大學農學院 wss30 [32P] dATP通常用作放射性標記的探針。 放射自顯影檢測 ?particles blacken Xray film DNA固定在雜交膜上 2022/8/27 海南大學農學院 wss31 2022/8/27 海南大學農學院 wss32 （ 2）切口平移法（ Nick Translation） ? 原理及過程： ? 當雙鏈 DNA分子的一條鏈有切口時，大腸桿菌 DNA聚合酶 I可把核苷酸殘基加到切口處的 3’ 羥基端。由于該酶具有 5’ → 3 ’外切核酸酶活性，所以它可從切口的 5’端除去核苷酸。 5’端除去與 3’端加入核苷酸同時進行，導致切口沿著 DNA模板鏈移動。隨著反應的進行，底物中被標記的單核苷酸被隨機摻入。 DNA聚合酶 I的兩種作用交替進行，探針即被標記。 2022/8/27 海南大學農學院 wss33 切口轉移 2022/8/27 海南大學農學院 wss34 2022/8/27 海南大學農學院 wss35 DNA探針制備 用 DNA模板制備單鏈 DNA探針的方法有： （ 1）合成可克隆于噬菌粒或 M13噬菌體載體上的DNA為模板，合成與其序列互補的探針；需要分離探針與未標記的核酸。 （ 2）將克隆于特定載體上靶序列轉錄成 RNA的探針。用不含有 RNA酶的 DNA酶 Ⅰ 極易除去模板DNA。 2022/8/27 海南大學農學院 wss36 2022/8/27 海南大學農學院 wss37 DNA探針 在 PCR循環(huán)過程， Tag DNA聚合酶可將標記的 dNTP摻入 DNA鏈中，用此法制備的探針靈敏度高，數(shù)量大。 2022/8/27 海南大學農學院 wss38 PCR合成 DNA探針 Labeling in a polymerase chain reaction ? 在 PCR反應里有用 DIG 或 32P標記了的 dNTP : 2022/8/27 海南大學農學院 wss39 1） 3’端寡核苷酸探針 2） 3’端尾部寡核苷酸探針 3） 5’端寡核苷酸探針 2022/8/27 海南大學農學院 wss40 (a) 5180。pNpNp………NpNpN OH3180。 DNA or RNA ddAp*pp ??? 末端轉移酶 +α32PddATP 5180。pNpNpNpNp………Np (a) NpApA—pA－－ H 3180。 3180。末端標記（ 3180。 end labelling） (a) 單鏈 (DNA or RNA) 標記用末端轉移酶 2022/8/27 海南大學農學院 wss41 2022/8/27 海南大學農學院 wss42 3180。末端標記 (b) 雙鏈 DNA 用 DNA 聚合酶 2022/8/27 海南大學農學院 wss43 5180。N………GGATCC……..N 3180。 DNA 3180。N………CCTAGG……..N 5180。 dAp*pp ??? DNA 聚合酶 + ?32PdATP + dCTP, dGTP, dTTP 5180。N………G 3180。 5180。GATCC……..N 3180。 3180。N………CCTAG 5180。 3180。G……..N 5180。 5180。N………G GATC GATCC……..N 3180。 3180。N………CCTAG CTAGG……..N 5180。 用 BamHI 限制性內切酶消化 RE DNA 片斷 3180。末端被標記 2022/8/27 海南大學農學院 wss44 2022/8/27 海南大學農學院 wss45 5180。末端標記（ 5180。 end labelling） ? 是一個兩步反應 。 ? 適用于 RNA和雙鏈或單鏈 DNA。 ? 堿性磷酸酶、 T4 噬菌體多核苷酸激酶和 ?32PATP。 ? DNA 5′ 末端的磷酸根，用堿性磷酸酶去磷酸化，再用 T4多
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