【文章內(nèi)容簡介】 4℃保存。， %濃度使用?！　?5)特異性抗體(第一抗體) 熒光素標(biāo)記抗體（第二抗體）?！　?6)染色缸、濕盒、振蕩儀、熒光顯微鏡。　　染色的基本步驟　　(1)細胞準(zhǔn)備 將7mm22mm蓋玻片置入培養(yǎng)瓶中，加入對數(shù)生長期細胞懸液于培養(yǎng)瓶中，待細胞長成單層，取出蓋玻片，用PBS洗2次；懸浮生長的細胞離心后用PBS離心洗滌2次，制成細胞涂片?！　?2)細胞固定 用醋酸/甲醇或95%酒精固定20～30分鐘?！　?3)將固定的細胞玻片置入蓋片染色缸，用PBS振洗5分鐘，取出吹干。　　(4)滴加稀釋的熒光素標(biāo)記抗體(%伊文氏藍溶液稀釋)，在濕盒中37℃保溫30～60分鐘?！　?5)PBS振洗2次，每次5分鐘，然后用蒸餾水振洗1次。　　(6)用50%緩沖甘油封片?！　?biāo)本染色后應(yīng)及時觀察并照相，若暫時無時間觀察則應(yīng)將標(biāo)本放入4℃冰箱保存。但過夜后特異性熒光會減弱。如用聚乙稀醇封片，則保存時間可適當(dāng)延長。制標(biāo)本和染色時必須設(shè)立陽性對照、陰性對照、空白對照及抑制試驗，以排除非特異性染色。要控制顯色反應(yīng)時間，以陽性反應(yīng)著色最強，而有的是剛開始著色為佳。滴加抗體的量要適當(dāng)，防止液體干涸?！　〈朔N染色法在熒光顯微鏡下觀察，陽性部位出現(xiàn)熒光。熒光素種類不同可出現(xiàn)不同顏色的熒光。如異硫氰酸熒光素呈黃綠色熒光，羅丹明B220呈橙紅色熒光。　　(三)免疫酶染色法　　ABC免疫酶染色法即卵白素—生物素—酶復(fù)合物法，是目前最敏感的免疫細胞化學(xué)染色法之一。其基本原理是將特異性第一抗體與組織細胞相應(yīng)抗原結(jié)合后，通過生物素化橋抗體與第一抗體結(jié)合，借助卵白素與生物素的天然親和性將生物素化辣根過氧化酶連接為復(fù)合物，通過酶促反應(yīng)，顯示組織細胞相應(yīng)的抗原。此法靈敏性高，對比度佳?！　?使用的主要材料　　 磷酸鹽緩沖液(, PBS)；TrisHCl緩沖液(, THB)；底物溶液[39。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，溶解于100mL THB中，過濾，然后加20uL 30%H2O2，及時使用]；ABC試劑盒(美國VECTOR公司產(chǎn)品，包括正常馬血清、生物素化馬抗小鼠IgG或馬抗兔IgG、卵白素—生物素化辣根過氧化物酶復(fù)合酶)；小鼠(兔)特異性抗體；蓋片染色缸、濕盒、顯微鏡等。　　染色的基本步驟　　(1)細胞準(zhǔn)備與固定，同免疫熒光染色法.　　(2)取已固定的細胞蓋片,用PBS洗5分鐘,%H2O2PBS(30%H2O2 5mL+PBS 200mL) 37℃3分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。　　(3)PBS振洗2次，每次3分鐘?！　?4)滴加正常馬血清，在濕盒內(nèi)，37℃保溫30分鐘，以消除非特異性染色?！　?5)棄去正常馬血清，滴加小鼠特異性抗體，在濕盒內(nèi)37℃保溫30～60分鐘或4℃下過夜?！　?6)PBS振洗3次,每次3分鐘,滴加生物素化馬抗小鼠IgG，在濕盒內(nèi)37℃30分鐘?！　?7)PBS振洗3次，每次3分鐘，滴加ABC復(fù)合劑，在濕盒內(nèi)37℃30分鐘?！　?8)PBS振洗2次，THB振洗1次，每次3分鐘，浸入新鮮配制的底物溶液，在室溫下置暗處10～20分鐘?！　?9)自來水洗5分鐘(若采用顯微分光光度計進行定量分折，則無需作細胞核襯染，直接進行脫水、透明和封片)。　　(10)細胞核襯染 浸入蘇木精染液染色2分鐘，自來水洗，迅速過鹽酸酒精溶液，自來水洗，過氨水溶液，自來水洗?！　?11)逐級脫水 過70%酒精1次，95%酒精2次，無水乙醇3次，每次1分鐘?！　?12)透明，過二甲苯溶液3次，每次1分鐘?！　?13)將有細胞的面向下，用中性樹脂封片。　　此種染色方法同免疫熒光染色一樣，也應(yīng)設(shè)置陽性對照、陰性對照、空白對照和抑制試驗。空白對照用PBS做第一抗體。抑制試驗是將待檢標(biāo)本與未標(biāo)記特異性抗體反應(yīng)后，再用自己標(biāo)記的特異性抗體進行染色，結(jié)果陽性強度減弱或轉(zhuǎn)為陰性。其注意事項同免疫熒光染色法?！　〈朔ㄈ旧Y(jié)果在光鏡下觀察，陽性部分呈棕褐色。　　(四)細胞銀染色法　　此法用于嗜銀蛋白分析。其基本原理是：核仁形成區(qū)(nucleolar organizer regions NORs)是位于某些近端著絲染色體短臂上含編碼核蛋白體RNA(rRNA)基因rDNA片段的環(huán)狀DNA。這個區(qū)存在的相關(guān)嗜銀蛋白(Ag NORs)是核仁內(nèi)高度磷酸化，并對銀有親和作用的酸性非組蛋白，對rDNA的轉(zhuǎn)錄、rRNA合成、加工和裝配起著重要的作用。AgNORs的含量可反映細胞增殖活性，其含量越高，表明細胞增殖越快。用銀染色法能特異顯示細胞AgNORs，通過計數(shù)AgNORs顆粒和測量AgNORs面積，可定量分析細胞AgNORs?！　?銀染色法需要的基本材料　　 50%硝酸銀和1%甲酸(v/v)需用去離子水配制；2%明膠甲酸溶液(稱明膠2g，溶入1%甲酸溶液100mL)；應(yīng)用染色液(在暗室內(nèi)將2%明膠甲酸溶液和5%硝酸銀溶液按1:2的容積比混合)需在染色前新鮮配制；潔凈的蓋片染色缸、吸管、載玻片、鑷子等?！　∪旧幕静襟E　　(1)細胞準(zhǔn)備與固定同前?！　?2)固定后的細胞玻片浸入去離子水中使其水化?！　?3)將應(yīng)用染色液滴加于細胞玻片上，室溫下避光染色1小時?！　?4)用去離子水反復(fù)沖洗，95%～100%系列酒精脫水?！　?5)用二甲苯透明。　　(6)中性樹脂封片?！　∪旧号渲埔欢ㄒ萌ルx子水。注意染色時間，不同組織標(biāo)本染色時間不同，其長短直接關(guān)系到AgNORs顆粒的計數(shù)結(jié)果，特別要注意。計數(shù)時每例樣本不得少于30個細胞數(shù)?！　∪旧诠忡R下可見到細胞核內(nèi)散著大小不等的黑色顆粒。定量分析可用目鏡形態(tài)定量學(xué)方法和自動圖像分析法。，以相互不連的顆粒定為一個計數(shù)點。后者采用圖像分析儀自動定量分析，先在光鏡下對待核細胞定位，通過攝像系統(tǒng)將細胞圖像信號輸入計算機，計算機對每一視場的顆粒個數(shù)及每一顆粒面積進行自動識別和計數(shù)?！　?五)考馬斯亮藍(Coomassie, BB)染色法　　這是一種顯示細胞骨架、細胞內(nèi)微絲的染色方法?！　?需用的材料　　 固定液[(NaH2PO4?2H2O), (NaH2PO4?12H2O)，相混合后再加25%]；染色液(，，)?！　∪旧幕静襟E　　(1)細胞準(zhǔn)備 用支持物蓋片培養(yǎng)法，待細胞長滿70～80%。　　(2)將有細胞的蓋片從培養(yǎng)瓶中取出，投入固定液中固定15分鐘?！　?3)先置蒸餾水漂洗2分鐘，再用蒸餾水沖洗兩次，每次1分鐘?！　?4)置入考馬斯亮藍染液中染色60分鐘?！　?5)先置蒸餾水漂洗2分鐘，再用蒸餾水沖洗兩次，每次1分鐘?！　?6)置入含甲醇冰醋酸液碟皿中(不含染料)，在倒置顯微鏡下觀察可見細胞質(zhì)內(nèi)微絲逐漸明顯，背地清亮?xí)r終止。　　(7)按(3)方法漂洗。　　(8)用70%～100%酒精逐級脫水?！　?9)用二甲苯透明?！　?10)用樹膠封固?！　∪旧逦年P(guān)鍵在第(6)步，要特別注意。染色片鏡下觀察，細胞內(nèi)微絲呈現(xiàn)藍色。　　　　第四節(jié) 細胞生長狀況有關(guān)指標(biāo)的檢測方法　　　　一、細胞計數(shù)　　這是細胞培養(yǎng)中常用的基本技術(shù)之一。所用材料為血球計數(shù)板，巴氏吸管和顯微鏡?！　〖毎嫈?shù)的基本步驟：　　(1)取清潔計數(shù)板和專用蓋玻片，用絲綢布輕輕拭干.　　(2)，(或臺盼至)染液，混勻后滴半滴于血球計數(shù)板內(nèi)，以充滿不外溢為宜。也可直接將細胞懸液在一側(cè)滴加到蓋玻片中，不要溢出，也不要過少或出現(xiàn)氣泡.　　(3)在顯微鏡下用10物鏡觀察計數(shù)四角大分格中的細胞數(shù)。代入下式得出細胞密度?！　?細胞數(shù)/ml=(4大格細胞數(shù)之和/4)104稀釋倍數(shù)　　臺盼藍染色法可計算出活細胞數(shù)和死細胞數(shù)以測定細胞存活百分率。%～1%的臺盼藍染液可使死細胞染成藍色，活細胞不著色。%的藻紅B染液將死細胞或受損細胞染成紅色，%的苯胺黑染液將死細胞染成黑色。　　 細胞存活百分率=（4大格活細胞數(shù)/4大格活細胞+死細胞數(shù)）100%　　細胞計數(shù)除用上述方法外，目前還有新型的自動計數(shù)儀，可供大規(guī)模細胞計數(shù)工作使用。各種型號的計數(shù)操作不盡相同，可根據(jù)使用說明進行操作。　　在進行細胞計數(shù)操作時，必須把細胞懸液準(zhǔn)備好，細胞應(yīng)分散良好，并充分混勻，若出現(xiàn)較多細胞團或細胞數(shù)少于200個/10mm2或多于500個/10mm2時，需重制細胞懸液，重新計數(shù)。　　二、細胞生長曲線和生長倍數(shù)　　細胞生長曲線是細胞培養(yǎng)實驗中最基本的指標(biāo)，是測定細胞絕對增長數(shù)值和生長繁殖基本規(guī)律常用的簡便方法。常用的方法為：在同一規(guī)格的培養(yǎng)瓶中，接種同等量的同一代細胞，經(jīng)培養(yǎng)后每隔24小時取出幾瓶細胞進行計數(shù)，以培養(yǎng)時間為橫座標(biāo)，不同時刻的細胞數(shù)的對數(shù)為底座標(biāo)，標(biāo)出各點并連成線，即為該細胞的生長曲線，可反應(yīng)出細胞生長的動態(tài)。　　測定生長曲線的另一種方法是用96孔/24孔細胞培養(yǎng)板，分7組，每組3孔，培養(yǎng)一周(7天)，期間逐日檢測