第二十章-蛋白質(zhì)的復(fù)性(編輯修改稿)
2024-09-01 10:44 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 包含體 溶解包含體 目標(biāo)構(gòu)建的構(gòu)型復(fù)原 對復(fù)性蛋白進(jìn)行純化獲得高純度的蛋白。 包含體顆粒內(nèi)并不一定多是表達(dá)產(chǎn)物，也可能含有其 他雜物，核酸，脂類，雜蛋白等 . 蛋白質(zhì)復(fù)性 主要蛋白質(zhì)復(fù)性的基本步驟和聯(lián)合實驗如下： （ 1）機(jī)械破碎（高壓勻漿，高速珠磨法） 離心法提取出包含體 加變性劑溶解 除變性劑復(fù)性。 （ 2）機(jī)械破碎 膜分離可溶性蛋白 變性溶解包含體 除變性劑復(fù)性。 （ 3） 化學(xué)破碎（加變性劑） 離心除細(xì)胞碎片 出除變性劑復(fù)性。 蛋白質(zhì)復(fù)性 路線 1的特點： 方法（ 1）：利用了包含體與細(xì)胞破碎片的密度差，用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性性蛋白質(zhì)分開，獲得包含體，再對包含體溶解后，復(fù)性，擺脫大量的雜蛋白，核酸，熱原，內(nèi)毒素等雜質(zhì)。 優(yōu)點：分離步驟簡單； 缺點：經(jīng)幾次離心后，才能除去大部分細(xì)胞碎片，加工時間長。 蛋白質(zhì)復(fù)性 蛋白質(zhì)復(fù)性 路線 2的特點： 方法（ 2）：應(yīng)用膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)，但載留細(xì)胞碎片和包含體。優(yōu)點：可進(jìn)行封閉式操作，不污染環(huán)境，也不受環(huán)境污染，耗能少。缺點：膜的堵塞和濃度極化常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留，這項技術(shù)問題較多。 蛋白質(zhì)復(fù)性 路線 3的特點： 方法（ 3）：所用試劑即可以破菌，又可以溶解包含體。將兩道工序合為一道，節(jié)省了設(shè)備和時間，比前兩者更適合實驗室操作。 缺點：混有雜質(zhì)，不易分離。 蛋白質(zhì)復(fù)性 ? 包含體復(fù)性的方法 包含體蛋白質(zhì)的復(fù)性是指使包含體內(nèi)的變性蛋白質(zhì)恢復(fù)其天然三維空間結(jié)構(gòu)從而具有生物學(xué)活性的過程 .一般分為以下幾種方法 : 1. 通過變性 復(fù)性的方法獲得正確構(gòu)象和生物活性的重組蛋白 .這是一種較通用的方法 . 蛋白質(zhì)復(fù)性 ? 包含體復(fù)性的方法 將通過細(xì)胞破碎 ,離心分離 ,多步清洗得到的” 純凈 ” 包含體 ,在強(qiáng)變性劑 (5~8mol/L尿素或 5~8mol/L的鹽酸胍 )中變性增溶 ,再將變性蛋白質(zhì)稀釋到適當(dāng)?shù)膹?fù)性緩沖液中 ,或通過對復(fù)性緩沖液透洗 \濃縮 ,最終得到重折疊的重組蛋白 .在溶液中變性 復(fù)性方法的關(guān)鍵是優(yōu)化折疊液和操作步驟 ,特別是對分子內(nèi)含多個二硫鍵的蛋白質(zhì)更是如此 .在此過程中 ,影響復(fù)性蛋白產(chǎn)率的因素有 : 蛋白質(zhì)復(fù)性 包含體復(fù)性的方法 影響復(fù)性蛋白產(chǎn)率的因素： (1) 復(fù)性蛋白的濃度 ,為防止蛋白質(zhì)分子間發(fā)生聚集 ,復(fù)性蛋白的濃度要盡量稀 ,一般控制在 2575 ug/mL為好 . (2) 復(fù)性緩沖液要保持適當(dāng)?shù)难趸€原條件 .一般GSSG（ 氧化型谷胱甘肽 ） 和 GSH之比為 1為好 .
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