法醫(yī)物證學(xué)各章知識(shí)整理(編輯修改稿)
2024-09-01 08:52 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 A指紋） ⑥探針標(biāo)記 ⑦分子雜交 ⑧譜帶顯示限制性酶選擇要求：①識(shí)別序列位于VNTR兩側(cè)，盡量靠近VNTR； ②酶活性、特異性穩(wěn)定，反應(yīng)條件容易控制； ③不受基因組DNA是否甲基化的影響。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）：類似半保留復(fù)制，在體外以基因組DNA為模板，以一對(duì)寡核苷酸為引物，dNTP為原料，在Taq DNA聚合酶的催化下，經(jīng)過(guò)變性、退火和引物延伸三步循環(huán)使目標(biāo)片段得到復(fù)制百萬(wàn)倍。PCR反應(yīng)體系：① 模板DNA，②寡核苷酸引物，③dNTP，④反應(yīng)緩沖液，⑤TaqDNA聚合酶。 循環(huán)參數(shù) ：溫度、時(shí)間PCR技術(shù)特點(diǎn)：①靈敏度高 ②特異性高 ③適用于降解DNA檢材 ④種屬特異性好 ⑤操作簡(jiǎn)單，時(shí)間短 ⑥儀器自動(dòng)完成 ⑦污染 ⑧樣本要求 ⑨影響因素多復(fù)合擴(kuò)增：經(jīng)過(guò)篩選的STR基因座，擴(kuò)增條件基本相同，可以在同一個(gè)PCR體系中擴(kuò)增多個(gè)靶基因座，叫作復(fù)合擴(kuò)增。應(yīng)用于法醫(yī)的STR應(yīng)滿足條件：① PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在300bp以下； ② 宜選擇四核苷酸STR基因組； ③ 選多個(gè)STR基因座應(yīng)不在同一條染色體上； ④ 每個(gè)STR基因座等位基因數(shù)810個(gè)左右； ⑤ 基因頻率分布均勻，沒(méi)有高或低頻基因出現(xiàn)； ⑥ 雜合度高，； ⑦ 低突變率%。不同DNA長(zhǎng)度分析技術(shù)比較：不同DNA長(zhǎng)度分析技術(shù)綜合評(píng)價(jià)：STR分型用于法醫(yī)物證鑒定的主要優(yōu)點(diǎn)：高靈敏度：適用于微量降解檢材。 高鑒別能力：節(jié)約檢材、試劑和提高效率。 標(biāo)準(zhǔn)化分型：實(shí)現(xiàn)數(shù)字化結(jié)果，利于實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)交換，建立數(shù)據(jù)庫(kù)。miniSTR：通過(guò)重新設(shè)計(jì)引物，使其結(jié)合在更靠近核心重復(fù)區(qū)的側(cè)翼序列，從而降低擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，進(jìn)一步提高靈敏度和分型成功率，這種技術(shù)稱為短片段STR分型或miniSTR分型。miniSTR的優(yōu)勢(shì)：216。①STR基因座的擴(kuò)增片段較短，靈敏度更高，尤其適用于極微量或嚴(yán)重降解生物檢材的DNA分型； 216。②等位基因片段長(zhǎng)度范圍較窄，不易發(fā)生因小等位基因的優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增而造成的等位基因丟失現(xiàn)象； 216。③可對(duì)多個(gè)STR基因座進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，從而節(jié)約檢材、降低成本，提高單次檢測(cè)的信息量miniSTR分型的局限性：因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的限制，構(gòu)建復(fù)合擴(kuò)增體系時(shí)只能同時(shí)擴(kuò)增較少的基因座（通常每種顏色的熒光標(biāo)記的基因座不超過(guò)2個(gè)）。要想達(dá)到與傳統(tǒng)的商品化試劑盒接近的個(gè)人識(shí)別能力，必須增加復(fù)合擴(kuò)增的次數(shù)。miniSTR引物與傳統(tǒng)的引物結(jié)合區(qū)之間若存在堿基的插入和缺失，易導(dǎo)致miniSTR與傳統(tǒng)STR分型結(jié)果的不一致。 3. 若某些STR基因座核心重復(fù)區(qū)上游或下游側(cè)翼序列存在嘌呤或嘧啶堿基堆積現(xiàn)象，則不利于miniSTR引物設(shè)計(jì)。 當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)小時(shí)，未消耗引物上的染料分子或稱“染料污斑”（dye blobs）可使產(chǎn)物峰變寬、信號(hào)變?nèi)?。這種影響在檢測(cè)降解生物樣本時(shí)更為明顯。 YSTR有何法醫(yī)學(xué)應(yīng)用特點(diǎn)：Y染色體為男性特有YSTR呈父系遺傳特征單倍體遺傳：在減數(shù)分裂過(guò)程中，Y特異性區(qū)不發(fā)生重組，所有YSTR基因座均呈連鎖遺傳，等位基因頻率不能以相乘方法計(jì)算GD=PE結(jié)果不具有唯一性，不能認(rèn)定。其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值在于排除YSTR分型中需要注意的問(wèn)題：①因?yàn)閄和Y染色體部分序列具有高度相似性，有些YSTR分型時(shí)在X染色體上也能檢出擴(kuò)增產(chǎn)物男性個(gè)體可見(jiàn)額外的產(chǎn)物峰，女性個(gè)體也可有分型結(jié)果。 ②部分YSTR基因座，有時(shí)可檢出二個(gè)或三個(gè)等位基因，易被誤認(rèn)為不同男性的混合樣本。第五章 STR自動(dòng)分型 STR自動(dòng)分型技術(shù)的主要步驟：DNA自動(dòng)化提取 PCR多色熒光標(biāo)記STR復(fù)合擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物電泳前處理 自動(dòng)毛細(xì)管電泳結(jié)合激光誘導(dǎo)的熒光檢測(cè) 自動(dòng)數(shù)據(jù)采集并分型 offladder：在STR分型圖譜中，常會(huì)遇到部分樣本的少量片段峰未被程序化數(shù)字命名，在分型圖譜中被標(biāo)識(shí)為offladder。漂移作用和新等位基因都可標(biāo)識(shí)為offladder低拷貝DNA（low copy number，LCN）：是指基因組含量小于100pg的樣本。第六章 DNA序列多態(tài)性PCR循環(huán)測(cè)序的基本原理：PCR技術(shù)能夠快速、特異性地?cái)U(kuò)增靶DNA，應(yīng)用PCR技術(shù)測(cè)定DNA序列分為兩個(gè)步驟：先利用PCR擴(kuò)增靶序列片段，制備測(cè)序模板，然后再利用PCR直接測(cè)定序列。PCR測(cè)序采用了熱循環(huán)高效合成DNA的特性并結(jié)合雙脫氧核苷酸終止法，使引物鏈終止的延伸產(chǎn)物數(shù)量在熱循環(huán)過(guò)程中得到增加，因此稱為循環(huán)測(cè)序。每個(gè)測(cè)序循環(huán)包括：①PCR擴(kuò)增制備的模板DNA變性成單鏈形式；②標(biāo)記引物與其中的一條鏈上的互補(bǔ)序列退火；③退火后的引物在耐熱DNA聚合酶催化下發(fā)生鏈延伸終止反應(yīng)。本次循環(huán)產(chǎn)生的模板鏈與延伸終止鏈形成的雙鏈的產(chǎn)物，在下一輪測(cè)序循環(huán)中，再次被變性，釋放出模板鏈，作為又一輪引發(fā)反應(yīng)的模板，同時(shí)積累下一輪循環(huán)產(chǎn)生的鏈終止產(chǎn)物。上述循環(huán)步驟重復(fù)20~40次，使鏈終止產(chǎn)物以線性方式獲得擴(kuò)增。DNA自動(dòng)測(cè)序技術(shù)：DNA自動(dòng)測(cè)序技術(shù)是以4種熒光染料基團(tuán)分別作為4種ddNTP終止鏈的標(biāo)記物，于20世紀(jì)80年代末期建立的一種高效、快速、自動(dòng)化的序列測(cè)定技術(shù)。4種熒光染料分別作為測(cè)序反應(yīng)中4種ddNTP終止鏈的標(biāo)記物，即4種被雙脫氧核苷酸終止的DNA片段分別帶上4種不同的顏色。這些DNA片段的混合物同時(shí)加在一個(gè)樣品槽中電泳展開(kāi)，相互間僅差1個(gè)堿基的DNA片段形成一條具有4種顏色的階梯分布圖像。階梯中的每 DNA片段由標(biāo)記在該片段上的特征性熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光所指示。熒光染料基團(tuán)作為
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