法醫(yī)物證學各章知識整理(編輯修改稿)
2025-09-01 08:52 本頁面
【文章內容簡介】 A指紋） ⑥探針標記 ⑦分子雜交 ⑧譜帶顯示限制性酶選擇要求：①識別序列位于VNTR兩側，盡量靠近VNTR； ②酶活性、特異性穩(wěn)定，反應條件容易控制； ③不受基因組DNA是否甲基化的影響。聚合酶鏈式反應（PCR）：類似半保留復制，在體外以基因組DNA為模板，以一對寡核苷酸為引物，dNTP為原料，在Taq DNA聚合酶的催化下，經(jīng)過變性、退火和引物延伸三步循環(huán)使目標片段得到復制百萬倍。PCR反應體系：① 模板DNA，②寡核苷酸引物，③dNTP，④反應緩沖液，⑤TaqDNA聚合酶。 循環(huán)參數(shù) ：溫度、時間PCR技術特點：①靈敏度高 ②特異性高 ③適用于降解DNA檢材 ④種屬特異性好 ⑤操作簡單，時間短 ⑥儀器自動完成 ⑦污染 ⑧樣本要求 ⑨影響因素多復合擴增：經(jīng)過篩選的STR基因座，擴增條件基本相同，可以在同一個PCR體系中擴增多個靶基因座，叫作復合擴增。應用于法醫(yī)的STR應滿足條件：① PCR擴增產物長度在300bp以下； ② 宜選擇四核苷酸STR基因組； ③ 選多個STR基因座應不在同一條染色體上； ④ 每個STR基因座等位基因數(shù)810個左右； ⑤ 基因頻率分布均勻，沒有高或低頻基因出現(xiàn)； ⑥ 雜合度高，； ⑦ 低突變率%。不同DNA長度分析技術比較：不同DNA長度分析技術綜合評價：STR分型用于法醫(yī)物證鑒定的主要優(yōu)點：高靈敏度：適用于微量降解檢材。 高鑒別能力：節(jié)約檢材、試劑和提高效率。 標準化分型：實現(xiàn)數(shù)字化結果，利于實驗室間數(shù)據(jù)交換，建立數(shù)據(jù)庫。miniSTR：通過重新設計引物，使其結合在更靠近核心重復區(qū)的側翼序列，從而降低擴增產物的大小，進一步提高靈敏度和分型成功率，這種技術稱為短片段STR分型或miniSTR分型。miniSTR的優(yōu)勢：216。①STR基因座的擴增片段較短，靈敏度更高，尤其適用于極微量或嚴重降解生物檢材的DNA分型； 216。②等位基因片段長度范圍較窄，不易發(fā)生因小等位基因的優(yōu)勢擴增而造成的等位基因丟失現(xiàn)象； 216。③可對多個STR基因座進行復合擴增，從而節(jié)約檢材、降低成本，提高單次檢測的信息量miniSTR分型的局限性：因擴增片段長度的限制，構建復合擴增體系時只能同時擴增較少的基因座（通常每種顏色的熒光標記的基因座不超過2個）。要想達到與傳統(tǒng)的商品化試劑盒接近的個人識別能力，必須增加復合擴增的次數(shù)。miniSTR引物與傳統(tǒng)的引物結合區(qū)之間若存在堿基的插入和缺失，易導致miniSTR與傳統(tǒng)STR分型結果的不一致。 3. 若某些STR基因座核心重復區(qū)上游或下游側翼序列存在嘌呤或嘧啶堿基堆積現(xiàn)象，則不利于miniSTR引物設計。 當PCR擴增產物過小時，未消耗引物上的染料分子或稱“染料污斑”（dye blobs）可使產物峰變寬、信號變弱。這種影響在檢測降解生物樣本時更為明顯。 YSTR有何法醫(yī)學應用特點：Y染色體為男性特有YSTR呈父系遺傳特征單倍體遺傳：在減數(shù)分裂過程中，Y特異性區(qū)不發(fā)生重組，所有YSTR基因座均呈連鎖遺傳，等位基因頻率不能以相乘方法計算GD=PE結果不具有唯一性，不能認定。其法醫(yī)學應用價值在于排除YSTR分型中需要注意的問題：①因為X和Y染色體部分序列具有高度相似性，有些YSTR分型時在X染色體上也能檢出擴增產物男性個體可見額外的產物峰，女性個體也可有分型結果。 ②部分YSTR基因座，有時可檢出二個或三個等位基因，易被誤認為不同男性的混合樣本。第五章 STR自動分型 STR自動分型技術的主要步驟：DNA自動化提取 PCR多色熒光標記STR復合擴增 PCR產物電泳前處理 自動毛細管電泳結合激光誘導的熒光檢測 自動數(shù)據(jù)采集并分型 offladder：在STR分型圖譜中，常會遇到部分樣本的少量片段峰未被程序化數(shù)字命名，在分型圖譜中被標識為offladder。漂移作用和新等位基因都可標識為offladder低拷貝DNA（low copy number，LCN）：是指基因組含量小于100pg的樣本。第六章 DNA序列多態(tài)性PCR循環(huán)測序的基本原理：PCR技術能夠快速、特異性地擴增靶DNA，應用PCR技術測定DNA序列分為兩個步驟：先利用PCR擴增靶序列片段，制備測序模板，然后再利用PCR直接測定序列。PCR測序采用了熱循環(huán)高效合成DNA的特性并結合雙脫氧核苷酸終止法，使引物鏈終止的延伸產物數(shù)量在熱循環(huán)過程中得到增加，因此稱為循環(huán)測序。每個測序循環(huán)包括：①PCR擴增制備的模板DNA變性成單鏈形式；②標記引物與其中的一條鏈上的互補序列退火；③退火后的引物在耐熱DNA聚合酶催化下發(fā)生鏈延伸終止反應。本次循環(huán)產生的模板鏈與延伸終止鏈形成的雙鏈的產物，在下一輪測序循環(huán)中，再次被變性，釋放出模板鏈，作為又一輪引發(fā)反應的模板，同時積累下一輪循環(huán)產生的鏈終止產物。上述循環(huán)步驟重復20~40次，使鏈終止產物以線性方式獲得擴增。DNA自動測序技術：DNA自動測序技術是以4種熒光染料基團分別作為4種ddNTP終止鏈的標記物，于20世紀80年代末期建立的一種高效、快速、自動化的序列測定技術。4種熒光染料分別作為測序反應中4種ddNTP終止鏈的標記物，即4種被雙脫氧核苷酸終止的DNA片段分別帶上4種不同的顏色。這些DNA片段的混合物同時加在一個樣品槽中電泳展開，相互間僅差1個堿基的DNA片段形成一條具有4種顏色的階梯分布圖像。階梯中的每 DNA片段由標記在該片段上的特征性熒光基團發(fā)出的熒光所指示。熒光染料基團作為
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