南農(nóng)傳染病實(shí)習(xí)報(bào)告(編輯修改稿)
2024-09-01 03:50 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 病料的無(wú)菌處理a) 將保存的組織懸液反復(fù)凍融三次后加入EP管中，12000rpm離心15min， 取上清。b) 將滅菌的小濾器置于無(wú)菌的小青瓶上，用注射器吸取離心后的上清，將注射器與濾器相接，用力壓注射器活塞，使上清通過(guò)濾器，濾液即為無(wú)菌的含有病毒的組織上清，置于20℃冰箱凍存?zhèn)溆没蚪臃N細(xì)胞。2． 細(xì)胞接種a) 鏡檢觀(guān)察待細(xì)胞板上細(xì)胞鋪滿(mǎn)單層，棄去細(xì)胞板中的營(yíng)養(yǎng)液；b) 在細(xì)胞板中加入過(guò)濾后的組織上清液200μL，同時(shí)設(shè)定陰陽(yáng)性對(duì)照。c) 使其鋪滿(mǎn)細(xì)胞表面，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱孵育半小時(shí)；d) 棄去組織濾液，在細(xì)胞中加入細(xì)胞維持液500μL，37176。C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和有無(wú)細(xì)胞病變。（三） 結(jié)果1. 接種剖解豬的肺臟的病料的培養(yǎng)皿上沒(méi)有長(zhǎng)菌，長(zhǎng)的也是污染的菌，因?yàn)榫湫螒B(tài)較大，白色。2. 接種陽(yáng)性病料的板子長(zhǎng)了三個(gè)菌落，一個(gè)較大，可能是雜菌，另外兩個(gè)較小，疑似副豬嗜血桿菌，所以就用這兩個(gè)菌落接入TSB液體培養(yǎng)基中3. 另外一塊板子上長(zhǎng)得菌落稍大，并且在光下，45度角，可見(jiàn)藍(lán)色熒光，所以也來(lái)接種鑒定一下。4. 編號(hào)1的是陽(yáng)性疑似副豬，編號(hào)3為疑似巴氏桿菌的培養(yǎng)，待明天上午觀(guān)察結(jié)果。第四天：細(xì)菌的生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)和細(xì)菌鑒定以及觀(guān)察接種細(xì)胞(一) 上午觀(guān)察TSB培養(yǎng)基中細(xì)菌生長(zhǎng)情況(二) 晚上觀(guān)察病毒液接種的細(xì)胞，是否有細(xì)胞病變。(三) 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)1. 用涂布棒將1號(hào)與3號(hào)細(xì)菌接種于TSA平板上，將各種抗菌藥物圓紙片（任選7種）分別貼于培養(yǎng)基表面，各片距離要相等，37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)24h檢查。2. 藥敏試紙片種類(lèi)：頭孢噻肟、頭孢曲松、阿米卡星、青霉素G、氨芐西林、頭孢唑啉、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、阿莫西林、阿奇霉素、慶大霉素、新霉素、氯霉素、紅霉素、林可霉素、復(fù)方新諾明。我們小組選擇的是環(huán)丙霉素、紅霉素、諾氟沙星、阿莫西林、林可霉素、復(fù)方新諾明、阿奇霉素3. 結(jié)果判定：根據(jù)藥物紙片周?chē)袩o(wú)抑菌圈及其直徑大小，來(lái)判斷細(xì)菌對(duì)藥物的敏感程度。無(wú)抑菌圈，細(xì)菌對(duì)該抗生素不敏感；抑菌圈小于10mm，對(duì)該抗生素低度敏感。(四) 細(xì)菌的生化試驗(yàn)1. 用接種針（無(wú)菌）取分離的細(xì)菌24h純培養(yǎng)物分別接種到含葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、D核糖和麥芽糖培養(yǎng)基的生化管內(nèi)，開(kāi)口向下，放滅菌培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)24h，觀(guān)察結(jié)果并記錄。2. 同時(shí)進(jìn)行脲酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)和接觸酶試驗(yàn)。a) 糖類(lèi)分解試驗(yàn)：原理：接種細(xì)菌若發(fā)酵某種糖或醇，可產(chǎn)酸，使培養(yǎng)液顏色由紫色變?yōu)辄S色；如發(fā)酵的同時(shí)又產(chǎn)生氣體，培養(yǎng)液顏色由紫色變?yōu)辄S色的同時(shí)，在微量發(fā)酵管頂部積有氣泡。結(jié)果判定：接種后24h觀(guān)察結(jié)果。產(chǎn)酸，培養(yǎng)液顏色由紫色變?yōu)辄S色；產(chǎn)酸產(chǎn)氣，培養(yǎng)液顏色由紫色變?yōu)辄S色，并在微量發(fā)酵管頂部積有氣泡。b) 脲酶試驗(yàn)原理：細(xì)菌分解尿素產(chǎn)生兩分子氨，培養(yǎng)基pH升高，指示劑酚紅顯示出紅色，即證明細(xì)菌有脲酶。接種方法及結(jié)果判定：用接種環(huán)將細(xì)菌培養(yǎng)物接種與尿素瓊脂斜面，不要穿刺到底，下部留作對(duì)照。1～6h觀(guān)察，有時(shí)需要24h到6d。陽(yáng)性反應(yīng)，則瓊脂斜面有粉紅到紫紅色。陰性反應(yīng)，不變色。c) 氧化酶試驗(yàn)原理：氧化酶或稱(chēng)細(xì)胞色素氧化酶，是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶。作氧化酶試驗(yàn)時(shí)，此酶首先使細(xì)胞色素C氧化，然后氧化型細(xì)胞色素C再使對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。接種方法及結(jié)果判定：取白色潔凈濾紙沾取菌落。加鹽酸二甲基對(duì)苯二胺溶液一滴，陽(yáng)性者呈現(xiàn)粉紅色，并逐漸加深，再加α萘酚溶液一滴，陽(yáng)性者于半分鐘內(nèi)呈現(xiàn)鮮藍(lán)色。陰性于兩分鐘內(nèi)不變色。d) 接觸酶試驗(yàn)（也叫做觸媒實(shí)驗(yàn)或者過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)）原理：具有過(guò)氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過(guò)氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣泡。 接種方法及結(jié)果判定：取槽置于潔凈的試管內(nèi)或玻片上，然后加3％過(guò)氧化氫數(shù)滴；或直接滴加3％過(guò)氧化氫于不含血液的細(xì)菌培養(yǎng)物中，立即觀(guān)察結(jié)果。有大量氣泡產(chǎn)生者為陽(yáng)性。不產(chǎn)生氣泡者為陰性。e) 硫化氫試驗(yàn)：原理：細(xì)菌分解含硫氨基酸，產(chǎn)生硫化氫，與培養(yǎng)基中的醋酸鉛或硫酸亞鐵發(fā)生反應(yīng)，形成黑色的硫化氫或硫化亞鐵。結(jié)果判定：接種后24h觀(guān)察結(jié)果，培養(yǎng)液變黑為陽(yáng)性，不變色為陰性。(五) 鏡檢參照第一天顯微鏡檢查細(xì)菌的方法進(jìn)行操作將接于TSB液體培養(yǎng)基24h生長(zhǎng)的細(xì)菌用接種環(huán)涂布于玻片進(jìn)行染色鏡檢，用油鏡觀(guān)察。(六) 細(xì)菌的鑒定根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA的序列設(shè)計(jì)引物對(duì)元代培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行PCR可以快速準(zhǔn)確的診斷出副豬嗜血桿菌病。引物 HSP1：GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT HSP2：GGC TTC GTC ACC CTC TGTPCR體系（25μL體系） Mix 2 HSP1 2μL25 μL HSP2 2μL 模板DNA 2μL 酶
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