【文章內(nèi)容簡介】 同時(shí)壓縮了一些驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，增加了一些創(chuàng)新性、設(shè)計(jì)性和綜合性實(shí)驗(yàn)。這些改革符合實(shí)驗(yàn)教學(xué)的發(fā)展趨勢，突出了實(shí)驗(yàn)教學(xué)的重要地位，提高學(xué)生了綜合實(shí)驗(yàn)水平。課程負(fù)責(zé)人：生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄧林偉。二O O 八年一月植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教學(xué)大綱1．實(shí)驗(yàn)課程號：20587B22．課程屬性：（必修）3．實(shí)驗(yàn)屬性：獨(dú)立設(shè)課4．學(xué)時(shí)學(xué)分：總學(xué)時(shí)總學(xué)分15．實(shí)驗(yàn)應(yīng)開學(xué)期：春季6．先修課程：植物學(xué)實(shí)驗(yàn)、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)一、課程的性質(zhì)與任務(wù)植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)在生物科學(xué)的發(fā)展中起著很重要的作用，它與工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥和環(huán)保等各領(lǐng)域都有著十分廣泛而又密切的聯(lián)系，并且它已成為生命科學(xué)研究中非常重要的手段。植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中重要組成部分。植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)種植類專業(yè)及其相關(guān)專業(yè)的少數(shù)幾門主干課程之一，屬于專業(yè)基礎(chǔ)課，也是必修實(shí)驗(yàn)課。植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課程主要是培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)踐能力和創(chuàng)新能力。它的作用不僅僅是以形象生動(dòng)的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象幫助學(xué)生加深理解與掌握理論知識，而且是培養(yǎng)學(xué)生將理論知識應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，提高學(xué)生的動(dòng)手操作能力，在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)問題、分析問題、解決問題的能力和培養(yǎng)開拓創(chuàng)新精神的有效途徑。二、實(shí)驗(yàn)的目的與基本要求植物生理學(xué)是一門實(shí)驗(yàn)性學(xué)科，它之所以能夠得到迅速發(fā)展，與植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的突飛猛進(jìn)密切相關(guān)。因此，植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課程是植物生理學(xué)教學(xué)的重要組成部分，加強(qiáng)和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)是提高植物生理學(xué)教學(xué)質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。要求四年制農(nóng)大本科相關(guān)專業(yè)學(xué)生熟練掌握以下三種基本功：1． 通過實(shí)驗(yàn)，增加感性認(rèn)識，印證和強(qiáng)化基本理論知識。2． 掌握重要植物生理指標(biāo)的測定方法及相關(guān)的儀器使用方法。3． 訓(xùn)練觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，記錄、分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和寫作實(shí)驗(yàn)報(bào)告的能力。培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)肅認(rèn)真、實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度和科學(xué)作風(fēng)；提高學(xué)生分析問題和解決問題的能力。在教學(xué)過程中，要求學(xué)生每次實(shí)驗(yàn)前預(yù)習(xí)好實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)的有關(guān)內(nèi)容；掌握實(shí)驗(yàn)的目的和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理；了解實(shí)驗(yàn)操作的基本過程及注意事項(xiàng)。上實(shí)驗(yàn)課時(shí)教師必需認(rèn)真講解實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和操作要點(diǎn)，細(xì)心指導(dǎo)和演示操作步驟；學(xué)生應(yīng)仔細(xì)觀察實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的各種現(xiàn)象，如實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)，并聯(lián)系有關(guān)理論內(nèi)容積極思考，力求理解每一實(shí)驗(yàn)步驟及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的意義；書寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求簡明扼要、字跡清楚、規(guī)范整潔、結(jié)果正確；實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意勤儉節(jié)約，安全有序。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)及時(shí)清洗儀器，打掃實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生，關(guān)閉好門窗水電；教師必需認(rèn)真負(fù)責(zé)地巡視檢查實(shí)驗(yàn)課的各個(gè)環(huán)節(jié)，并認(rèn)真評閱好實(shí)驗(yàn)報(bào)告。三、實(shí)驗(yàn)考核方式及辦法植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)課程采用筆試和操作技能相結(jié)合的辦法進(jìn)行，筆試以百分制計(jì)分，技能操作按A（優(yōu)秀）、B（良好）、C（及格）和D（不及格）評價(jià)。四、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目一覽表植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目一覽表序號實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目名稱實(shí)驗(yàn)類型實(shí)驗(yàn)要求適用專業(yè)學(xué)時(shí)1植物組織水勢的測定（小液流法）設(shè)計(jì)性必做農(nóng)科類32植物組織滲透勢的測定（質(zhì)壁分離法）綜合性必做農(nóng)科類33葉綠體色素的提取及定量測定驗(yàn)證性必做農(nóng)科類44葉綠體色素的分離及理化性質(zhì)觀察綜合性必做農(nóng)科類45植物種子生活力的快速測定驗(yàn)證性必做農(nóng)科類36植物根系活力的測定（TTC法）驗(yàn)證性必做農(nóng)科類3五、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的具體內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)一 植物組織水勢的測定（小液流法）1．實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆罩参锝M織水勢的組成；掌握小液流法測定植物組織水勢的方法。2．實(shí)驗(yàn)內(nèi)容成熟細(xì)胞水勢主要決定于壓力勢（ψ p）和滲透勢（ψ s）。對于外液（如蔗糖溶液）而言，只具有水勢或滲透勢ψ s=iCRT，R、T均為常數(shù)，先要知道蔗糖重量摩爾濃度C，則可知蔗糖溶液水勢。該實(shí)驗(yàn)的目的是求得細(xì)胞水勢，其中的ψ p很難測定，故只有把細(xì)胞水勢與蔗糖溶液水勢聯(lián)系起來，間接利用蔗糖溶液的滲透勢計(jì)算公式求出細(xì)胞水勢。怎樣將兩者聯(lián)系起來是該實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。將已知濃度的蔗糖溶液分裝于兩個(gè)容器中，在其中一個(gè)加入植物材料，這樣就將植物細(xì)胞與蔗糖溶液處于一個(gè)系統(tǒng)之中，依水分總是從水勢高的區(qū)域向水勢低的區(qū)域移動(dòng)的原理，當(dāng)植物細(xì)胞水勢與蔗糖溶液水勢不相等時(shí)，它們之間就有水分移動(dòng)，主要有以下三種情形：水勢大小水分移動(dòng)方向蔗糖溶液（比重）變化小液滴移動(dòng)方向ψ w細(xì)胞＜ψ w糖液糖液→細(xì)胞增加下沉ψ w細(xì)胞＝ψ w糖液動(dòng)態(tài)平衡不變原處擴(kuò)散ψ w細(xì)胞＞ψ w糖液細(xì)胞→糖液減少上升因此，如果液滴在原處擴(kuò)散，即表示濃度不變，此溶液濃度的水勢就等于植物組織的水勢，而蔗糖溶液的水勢ψ w = iCRT，只要知道蔗糖溶液的重量摩爾濃度C，即可知其水勢，我們觀察時(shí)，如沒有原處擴(kuò)散現(xiàn)象，則取上升與下降的兩相鄰試管所對應(yīng)的蔗糖濃度的平均值作為公式中的C。3．需用的儀器或試劑（1）儀器設(shè)備：帶刻度試管；彎頭滴管；鑷子；打孔器；培養(yǎng)皿。（2）試劑：、；甲烯藍(lán)粉末。4．實(shí)驗(yàn)步驟（1）～；分取2ml于對應(yīng)的青霉素瓶和分取3ml于對應(yīng)指形管。（2）在每個(gè)青霉素瓶中各放20片葉圓片，不時(shí)搖動(dòng)，30min后，各加微量的甲烯蘭充分搖勻，顯淺蘭色。（3）用彎頭毛細(xì)管吸一小滴溶液擠入對應(yīng)的指形管中，同時(shí)觀察液滴移動(dòng)情況，記錄結(jié)果于下表：蔗糖濃度（m）液滴移動(dòng)方向（4）結(jié)果計(jì)算：ψw =－iCRT（巴）其中i=1，R=Kgmol1K1 ，C為等滲濃度（mol/L）。C=(下沉最高濃度+上升最低濃度)/25．教學(xué)方式：室內(nèi)實(shí)驗(yàn)6．考核要求掌握植物組織水勢的測定方法。7．實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求：按時(shí)提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)二 植物組織滲透勢的測定（質(zhì)壁分離法）1．實(shí)驗(yàn)?zāi)康木毩?xí)利用質(zhì)壁分離法測定植物細(xì)胞的滲透勢。2．實(shí)驗(yàn)內(nèi)容植物細(xì)胞的水勢由滲透勢、壓力勢、襯質(zhì)勢組成，因成熟細(xì)胞內(nèi)襯質(zhì)勢一般可忽略不計(jì)，因而在測定滲透勢時(shí)，由于滲透勢隨植物細(xì)胞的體積變化比較微小，當(dāng)植物組織處在某種濃度的溶液中發(fā)生初始質(zhì)壁分離，并且組織細(xì)胞內(nèi)的汁液周圍的溶液處于滲透平衡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的壓力勢為零，此時(shí)植物組織的滲透勢就等于外部溶液的滲透勢。將植物組織放在濃度呈現(xiàn)梯度的一系列蔗糖水溶液中，然后觀察質(zhì)壁分離現(xiàn)象，找到剛剛引起初始質(zhì)壁分離時(shí)的濃度和與其鄰近的尚不能引起質(zhì)壁分離的濃度，則壓力勢等于零時(shí)的等滲濃度介于其間，而ψ s=－iCRT，即可近似地求出其滲透勢，而蔗糖的解離系數(shù)i=1。3．需用的儀器或試劑（1）儀器設(shè)備：顯微鏡、鑷子、載玻片、蓋玻片、刀片、（?。?、移液管、培養(yǎng)皿。（2）試劑：%中性紅溶液；～。4．實(shí)驗(yàn)步驟(1) 將洋蔥（大蒜）切成都11cm2的小塊，撕下內(nèi)表皮或外表皮，放在培養(yǎng)皿中，加入25ml %的中性紅溶液染色10～15min。如是有顏色的外表皮可以不染色。(2) 取出內(nèi)表皮或外表皮,用吸水紙吸干染料，迅速分別投入各種濃度的蔗糖溶液中（每一濃度至少一片，將其完全浸入。(3) 10min后，從高濃度開始依次取出表皮薄片，放在滴有同樣溶液的載玻片上，蓋上蓋玻片，鏡檢，并記錄質(zhì)壁分離的相對程度。實(shí)驗(yàn)中必須確定一個(gè)引起半數(shù)以上細(xì)胞原生質(zhì)剛剛從細(xì)胞壁的角隅上分離的最低濃度以及不引起質(zhì)壁分離的最高濃度。細(xì)胞的滲透勢近似地與這兩個(gè)極限溶液濃度之平均值所對應(yīng)的滲透勢相等。 (4) 測出引起質(zhì)壁分離剛開始的蔗糖溶液最低濃度C1和與其相鄰的不引起質(zhì)壁分離最高濃度C2之后，可按公式計(jì)算在常壓下該組織細(xì)胞的滲透勢： ψ s=－iCRT=－CT R──氣體常數(shù)，kgmol1K1 T──絕對溫度 i──解離常數(shù)，蔗糖等于1 C──等滲透溶液的重量摩爾濃度；C=(C1+C2)/2蔗糖濃度（m）質(zhì)壁分離的細(xì)胞百分率（%）質(zhì)壁分離相對程度（作圖）5．教學(xué)方式：室內(nèi)實(shí)驗(yàn)6．考核要求掌握植物組織滲透勢的測定方法。7．實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求：按時(shí)提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)三 葉綠體色素的提取及定量測定1．實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆展夂仙氐奶崛『投繙y定方法。2．實(shí)驗(yàn)內(nèi)容根據(jù)朗伯比爾定律，某有色溶液的吸光度D與其中溶液濃度C和液層厚度L成正比，即：A=KCL。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長下吸光度的總和，這就是吸光度的加和性。測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需用測定該提取液在三個(gè)特定波長下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。葉綠素a、b的丙酮溶液在可見光范圍內(nèi)的最大吸收峰分別位于紅光區(qū)和藍(lán)紫光區(qū)，為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。已知葉綠素a、b的80%丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm和645nm。又知在波長663nm下，葉綠素a、在波長645nm下，可根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式：A663=+ (1)A645=+ (2)式 (1)、（2）中的A663和A645為葉綠素溶液在波長663nm和645nm時(shí)的吸光度；Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度，以mg/L為單位。解方程組（1）、（2），得：Ca= (3)Cb= (4)將Ca與Cb相加即得葉綠素總量Ct：Ct=Ca+Cb=+ (5)由于葉綠素a、b在652nm的吸收峰相交，兩者有相同的比吸收系數(shù)（），也可以在此波長下測定一次吸光度（A652）而求出葉綠素a、b總量：Ct=Ca+b=A6521000/ (6)丙酮提取液中類胡蘿卜素的含量：Ck=+b (7)3．需用的儀器或試劑（1）儀器設(shè)備：分光光度計(jì)、天平、研缽、棕色容量瓶、小漏斗、定量濾紙、吸水紙、擦鏡紙、滴管。（2）試劑：80%丙酮、石英砂、碳酸鈣粉4．實(shí)驗(yàn)步驟（1） 取新鮮植物葉片，擦凈組織表面污物，剪碎，混勻。（2） ，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2～3mL80%丙酮，研成勻漿，再加80%丙酮5mL，繼續(xù)研磨至組織變白。（3） 過濾收集至25mL容量瓶中，用少量80%丙酮沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后用80%丙酮定容至25mL，搖勻。（4） 將上述色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)，以80%丙酮為空白，在波長663nm、645nm、652nm和440nm下測定光密度。（5） 結(jié)果計(jì)算將測得的光密度值代入公式，分別計(jì)算chla、chlb、chla+chlb和類胡蘿卜素的濃度（mg/L）。并按下式計(jì)算組織中單位鮮重中各色素的含量：稀釋倍數(shù)：若提取液未經(jīng)稀釋，則取1。5．教學(xué)方式：室內(nèi)實(shí)驗(yàn)6．考核要求掌握光合色素的提取和定量測定方法。7．實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求：按時(shí)提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)四 葉綠體色素的分離和理化性質(zhì)的觀察1．實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庵参锶~綠體的色素的組成，掌握葉綠體色素提取、分離的方法，掌握各種光合色素理化性質(zhì)的鑒定。2．實(shí)驗(yàn)內(nèi)容提取：植物葉綠體色素是吸收可見太陽光能，進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)。它一般由葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。這些色素都不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，故可用乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑提取。分離：色素分離的方法有多種，紙層析是最簡便的一種。當(dāng)溶劑（有機(jī)推動(dòng)劑）不斷從紙上流過時(shí)，由于混合色素中各種成分在固定相（濾紙纖維素上所吸附的水分）和流動(dòng)相（有機(jī)推動(dòng)劑）間具有不同的分配系數(shù)，所以移動(dòng)速度不同，經(jīng)過一定時(shí)間后，可將各種色素分開。皂化作用：葉綠素是一種二羧酸（葉綠酸）與甲醇和葉綠醇形成的酯，故可與堿起皂化反應(yīng)而生成醇和葉綠酸的鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水中，可用此法將葉綠素與類胡蘿卜素分開。3．需用的儀器或試劑（1）儀器設(shè)備：研缽、漏斗、剪刀、滴管、大試管（帶膠塞）、大頭針、濾紙、天平、電吹風(fēng)、量筒、毛細(xì)管。（2）試劑：80%丙酮；石英砂；碳酸鈣粉；推動(dòng)劑(石油醚:丙酮=4 V:1 V)；4．實(shí)驗(yàn)步驟（1） 葉綠體色素的提?、?浸提法：，剪碎，放入25 mL容量瓶中，加25mL80%丙酮遮光浸提10hr，浸提液備用。② 研磨法：取植物新鮮葉片2g，洗凈，擦干，去掉中脈后剪碎，放入研缽中。研缽中加入少量石英砂及碳酸鈣粉，2~3ml 80%丙酮，研磨至糊狀，再加2~3mL80%丙酮，過濾，即得色素提取液。（2）葉綠體色素的分離：將上述提取液倒入燒杯中，將濾紙浸入色素提取液，吹干后再浸，反復(fù)多次，風(fēng)干后卷成紙捻，接于中心打有孔的圓形濾紙上，將小瓶裝上石油醚至瓶頸，再把紙捻插在瓶內(nèi)，圓形濾紙支于瓶口，罩上玻璃鐘罩。當(dāng)流動(dòng)相將色素推動(dòng)至圓形濾紙時(shí)，便向四周擴(kuò)散，不久即可看到被分離的各種色素的同心圓環(huán)。用鉛筆標(biāo)出各種色素的位置及名稱，注意各色素的顏色。（3）熒光現(xiàn)象的觀察：取1支試管加入濃的葉綠體色素提取液，在直射光下觀察溶液的透射光與反射光顏色有何不同，可觀察到反射出紅色的熒光。試解釋熒光產(chǎn)生的原因？（4）皂化作用（葉綠素與類胡蘿卜素的分離）：取葉綠體色素提取液2 mL于大試管中，加入4 mL乙醚，搖勻，再沿試管壁慢慢加入3～6 mL蒸餾水，輕輕混勻，靜置片刻，溶液即分為兩層，色素已全部轉(zhuǎn)入上層乙醚中。用滴管吸取上層綠色層溶液轉(zhuǎn)入另一試管中，再用蒸餾水沖洗1～2次。在色素乙醚溶液中加入30%KOH—甲