【文章內(nèi)容簡介】 易斷的環(huán)節(jié)動物等按頭部計數(shù)；軟體動物的死殼不計數(shù)。 標(biāo)本保存可將標(biāo)本（按站點(diǎn)和日期歸類）放置在加有少量95%變性乙醇的廣口瓶中，緊緊封住瓶口。必須定期檢查廣口瓶內(nèi)的乙醇高度，并在標(biāo)本瓶的乙醇減少之前，按需要補(bǔ)充。在廣口瓶外側(cè)附可黏貼標(biāo)簽，標(biāo)明樣品識別碼、日期以及防腐劑（95%變性乙醇）。將永久性標(biāo)簽分別附于標(biāo)本瓶內(nèi)外側(cè)，附以下信息：水體名稱、站位編號、日期、采集人姓名、防腐劑類型。 棲息密度換算（1）定量樣品實(shí)測個體總數(shù)量除以采樣總面積（人工基質(zhì)籠的總數(shù)），即可得該種類的棲息密度（ind/m2或ind/籠）。（2）定性樣品采集的樣品中同一種類個體數(shù)在1～9個之間計“＋”，表示“出現(xiàn)”；在10～29個之間計“＋＋”，表示“多”；大于30個計“＋＋＋”，表示“很多”。 結(jié)果填報將各點(diǎn)位的數(shù)據(jù)整理后填寫在鑒定結(jié)果表格里，見附表5。4 著生藻類監(jiān)測方法 設(shè)備及耗材 設(shè)備器材 著生藻類的采集采樣船、牙刷、鑷子、刀片、剪刀、樣品瓶、標(biāo)簽紙、丙烯酸纜繩、硅藻計、載玻片 實(shí)驗(yàn)室保存和鑒定配備100（油鏡）物鏡的復(fù)式顯微鏡、浮游生物計數(shù)框、電熱平板、鑷子、200μl移液槍、酒精燈，恒溫水浴鍋，膠頭滴管，（Eppendorf tube）、防酸手套等。 試劑 樣品固定固定劑：魯哥氏液（40g碘溶于含碘化鉀60g的1000ml水溶液中）福爾馬林（市售40%的甲醛溶液） 硅藻前處理濃鹽酸，濃硫酸，濃硝酸，雙氧水，75％酒精，蒸餾水。 藻類封片Naphrax膠（Robert Charles laboratories ltd. 羅伯特查爾斯實(shí)驗(yàn)室有限公司）或加拿大樹膠；二甲苯或甲苯；蒸餾水等。 野外采樣程序 采樣點(diǎn)設(shè)置一般情況下著生藻類的采樣點(diǎn)位、采樣頻次與底棲動物以及常規(guī)理化監(jiān)測的采樣點(diǎn)位保持一致。 著生藻類的樣品采集 人工基質(zhì)法（用于定量樣品的采集）人工基質(zhì)一般使用硅藻計法在河流中避開急流和漩渦，采樣時必須固定好器材，可以與底棲動物的籃式采樣器相連，通過調(diào)節(jié)繩子的長短，保證硅藻計距離水面5～10cm，使之得到合適的光照。同時可以參照《水質(zhì)微型生物群落監(jiān)測PFU法》（GB/T 1299091）的掛放方式進(jìn)行放置。每個采樣點(diǎn)至少放置2個人工基質(zhì)，以免由于不確定的事故造成損失。為了將人為的干擾或破壞降到最低，應(yīng)該將人工基質(zhì)隱藏在視野之外，避開走航、觀光河流的主干道。條件允許可以雇漁民看護(hù)。放置時間為14天。如果在此期間發(fā)生洪水或沖刷等情況，待水體平穩(wěn)后，重新安置人工基質(zhì)。定期了解采樣器材放置情況，如果樣品丟失要及時補(bǔ)樣。取樣時填寫采樣記錄（附表6）。 天然基質(zhì)法（多數(shù)用于定性樣品的采集）采集所有生境（淺灘、急流、淺池、近岸區(qū)域）不同基質(zhì)上的著生樣品，將所有樣品混合裝入樣品瓶中，貼上臨時標(biāo)簽（臨時標(biāo)簽可以只標(biāo)注樣品號或一次采集的統(tǒng)一編號）。表1 著生藻類采集技術(shù)基質(zhì)類型采集技術(shù)砂礫、卵石、圓石及樹木殘骸將基質(zhì)從水中緩慢移出，將表面相對較為光滑的和略帶綠色、藍(lán)綠色或棕黃色的部分用牙刷或小刀刮取到裝有蒸餾水的樣品瓶中苔蘚、大型藻類、維管植物、根塊剪取或刮取植物浸泡在水中，表面滑膩的部分，放入樣品瓶，加少量蒸餾水。大塊巖石、河床巖石、原木、樹木用牙刷或刮刀將直接將基質(zhì)上的藻類刮下，沖洗入樣品瓶中。注：若采集地點(diǎn)沒有可以采集的基質(zhì)，建議使用25號浮游生物網(wǎng)對水體的浮游種類進(jìn)行定性采集，以獲取較為豐富的種類類群。 樣品的固定與保存（1）定性樣品固定：按100:3的比例在樣品中加入市售的甲醛溶液。（2）定量樣品固定：按100:，鑒定完成后加入按定性樣品固定液的比例加入甲醛溶液以永久保存。（3）樣品保存：將樣品放入密封的樣品瓶中，置于統(tǒng)一的樣品柜中保存。 標(biāo)識與記錄（1）標(biāo)識：標(biāo)簽需標(biāo)注采樣地點(diǎn)、站位編號、日期、采集人姓名、固定液類型。在樣品記錄本上記錄與樣品編號相對應(yīng)的采樣地點(diǎn)、站位編號、日期與樣品類型，并建立電子檔案保存。并要定期檢查樣品瓶上的標(biāo)簽，進(jìn)行更換或補(bǔ)充，以防時間久后標(biāo)簽脫落褪色。（2）記錄：在野外記錄本或著生藻類采樣記錄表（附表A3）中記錄下河流名稱、采樣位置、站位編碼、采樣日期、采集人姓名、采樣方法及相關(guān)的生態(tài)信息。采樣完成后，在著生藻類樣品登記表（附表A4）中記錄下樣品信息，方便核對。 實(shí)驗(yàn)室分析 定性樣品 非硅藻樣品（1）預(yù)處理：方法一：常規(guī)制片法將采集到的定性樣品根據(jù)其樣品中個體密度適當(dāng)沉淀、濃縮至適宜體積，觀察時，將樣品充分搖晃均勻后靜置5～10s，膠頭滴管吸取液體中間略偏下位置的樣品滴放到載玻片上，制成臨時裝片鑒定并粗略計數(shù)，以獲得定性樣品中的優(yōu)勢種類。注：由于著生樣品中，多含有大量的泥沙，泥沙的重量普遍大于藻類植物，靜置可使其迅速沉淀至樣品瓶底，可減少大量雜質(zhì)對鑒定造成的干擾，靜置的同時會導(dǎo)致藻類輕微沉降，所有吸取液體中下部的樣品。方法二：甘油制片法甘油封片法：①配置甘油封片試劑：按照甲醛:甘油:蒸餾水的體積比為4:10:86配置甘油封片試劑；②按照一份（滴）樣品加兩份（滴）甘油封片試劑的比例置于載玻片上；③待蒸餾水揮發(fā)后（根據(jù)室溫、濕度條件不同有一定的差異，一般為24h）補(bǔ)充加封片試劑一次（兩份/兩滴）；④待蒸餾水再次揮發(fā)后蓋上蓋玻片置于顯微鏡下進(jìn)行鑒定，使用時間與外界條件有關(guān)，一般為2～3天。注：對于接觸生物監(jiān)測時間較短的人員來說，種類的鑒定較為困難，而臨時裝片會因空氣、光源等因素的影響導(dǎo)致樣品中的水分快速揮發(fā)，影響對樣品的觀察，如遇上述情況，可使用第二種方法制成甘油封片，減少鑒定中因外界因素產(chǎn)生的困難。（2）種類鑒定將樣品裝片置于1040倍顯微鏡下觀察鑒定至屬或種。推薦鑒定使用的文獻(xiàn)和工具書見參考文獻(xiàn)。 硅藻樣品（1）預(yù)處理由于硅藻種類的形態(tài)學(xué)鑒別主要依據(jù)其細(xì)胞壁上硅質(zhì)花紋的形態(tài)以及數(shù)量，因此在鑒定之前，首先對樣品進(jìn)行預(yù)處理，以去除藻體中的原生質(zhì)，只保留硅藻主要由二氧化硅組成的硅質(zhì)外殼。使用非硅藻樣品的取樣方法，預(yù)處理常用方法有以下幾種，可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室不同情況選取適合的方式。方法一：三酸法取15～20mL樣品置于玻璃試管中，離心5min；棄去上清液，保留沉淀；（以下步驟需在通風(fēng)櫥中進(jìn)行）用試管夾將試管夾好在酒精燈上加熱，是標(biāo)本中的液體全部蒸發(fā)；加入3～4滴濃鹽酸繼續(xù)加熱，直至顏色變深，液體大部分蒸發(fā)；加入2～4滴濃硫酸加熱，試管中的液體逐漸變黑，并產(chǎn)生大量氣泡；加熱直至試管中的液體變?yōu)樘亢谏辉佼a(chǎn)生氣泡并伴有白色氣體冒出；加入2～3滴濃硝酸，此時反應(yīng)劇烈并伴有響聲，有大量棕紅色氣體冒出；繼續(xù)加熱直至沉淀物變?yōu)榈S色活無色，氣體變?yōu)榘咨?。方法二：鹽酸硝酸法取樣品15～20mL，置于大玻璃試管中。在樣品中加入等體積的濃鹽酸混合，靜置24h；沸水浴加熱3～4h后靜置24h；棄去上清液，保留沉淀；加入2倍體積的濃硝酸沸水浴加熱5～6h，直至產(chǎn)生白色絮狀沉淀為止；靜置24h，棄去上清液，保留沉淀。方法三：雙氧水法取樣品15～20mL置于玻璃試管中，加入15mL濃鹽酸；沸水浴加熱至液體體積剩下1/2時，加入30mL雙氧水；繼續(xù)沸水浴加熱（同時不斷加入適量雙氧水）直至沉淀變?yōu)榈S色或白色。（2）處理后的樣品洗滌及保存方法將預(yù)處理后的樣品配平離心，以3000r/min的速度離心5min；用膠頭滴管棄去上清液，保留沉淀物，加入蒸餾水反復(fù)沖洗吹吸，再次離心。整個過程重復(fù)5～7次。（樣品中一般含有強(qiáng)腐蝕性的溶液，需使用玻璃離心管，離心時需注意防止液體飛濺以及離心管破裂造成的傷害）。，使用75%的酒精保存。由于酒精具有揮發(fā)性，需要每隔一段時間再次加入酒精。（3）永久封片制作方法方法一：加拿大樹膠封片用二甲苯浸泡加拿大樹膠，使其變?yōu)檎吵頎畹囊后w（大約需要兩周的時間）；將載玻片和蓋玻片洗凈、擦干，放到一旁保持干燥；搖晃裝有干凈標(biāo)本的微型離心管，使標(biāo)本的沉淀與酒精均勻混合成懸濁液；用移液槍取10～20μl的懸濁液，滴在蓋玻片上涂勻，放在熱平板上干燥；在載玻片中間滴一滴泡好的加拿大樹膠，將蓋玻片涂有標(biāo)本的一面向下蓋在膠上，使膠慢慢散開，接近或完全擴(kuò)散到整張蓋片上；用記號筆在載玻片做好標(biāo)記，防止混亂，在室溫下干燥；玻片在室溫通風(fēng)條件下完全干燥后（大約需要1～2周），即可觀察；待一次樣品封片全部制作完畢后統(tǒng)一制作、粘貼標(biāo)簽。方法二：Naphrax膠封片用甲苯浸泡Naphrax膠，使其粘稠度達(dá)到合適的程度；將載玻片和蓋玻片洗凈、擦干，放到一旁保持干燥；搖晃裝有干凈標(biāo)本的微型離心管，使標(biāo)本的沉淀與酒精均勻混合成懸濁液；用移液槍取10～20μl的懸濁液，滴在蓋玻片上涂勻，放在熱平板上干燥；在載玻片中間滴一滴泡好的Naphrax膠，將蓋玻片涂有標(biāo)本的一面向下蓋在膠上，使膠慢慢散開，接近或完全擴(kuò)散到整張蓋片上；將蓋好蓋玻片的載玻片用試管夾夾好，置于酒精燈上烤，待膠沸騰冒泡時停止加熱；用記號筆在載玻片做好標(biāo)記，防止混亂，待封片冷卻干燥后即可觀察；待一次樣品封片全部制作完畢后統(tǒng)一制作、粘貼標(biāo)簽。（4）種類鑒定將藻類封片樣品置于10100倍顯微鏡油鏡下鑒定分析至屬或種。推薦鑒定使用的文獻(xiàn)和工具書見參考文獻(xiàn)。 結(jié)果記錄鑒定記錄表格以及最終的數(shù)據(jù)統(tǒng)計表格參見附表9。 定量樣品（沉降計數(shù)法） 藻類預(yù)處理選用合適的器皿，盡量減少樣品轉(zhuǎn)移的次數(shù)，將著生藻類樣品濃縮、沉淀后，定容至20～50mL（根據(jù)不同樣品中生物個體的密度調(diào)整定容的體積）。將濃縮樣品充分搖晃均勻后，（圖41）鑒定計數(shù)。圖41 浮游生物計數(shù)框 藻類鑒定在1040顯微鏡下，將藻類鑒定至屬或種級分類水平。如有大量硅藻出現(xiàn)，建議按照定性樣品中對硅藻的處理方法進(jìn)行封片，在10100的顯微鏡下進(jìn)行鑒定，用此結(jié)果對1040倍鏡的鑒定結(jié)果進(jìn)行校正。 藻類計數(shù)（1）計數(shù)方法（水和廢水監(jiān)測分析方法長條計數(shù)法）在顯微鏡下，選取兩相鄰刻度從計數(shù)框的左邊一直計數(shù)到計數(shù)框的右邊稱為一個長條。與下沿刻度相交的個體，應(yīng)計數(shù)在內(nèi)，與上沿刻度相交的個體，不計數(shù)在內(nèi)，與上、下沿刻度都相交的個體，以生物體的中心位置作為判斷的標(biāo)準(zhǔn)，也可在低倍鏡下，按上述原則單獨(dú)計數(shù)，最后加入總數(shù)之中。一般計數(shù)三條，即第8條（如圖42a所示），若藻體數(shù)量太少，則應(yīng)全片計數(shù)。 a b 圖42 計數(shù)方法示意圖（a.《第四版》中要求的示意圖 ）（2）改進(jìn)的計數(shù)方法大多數(shù)鑒定人員都是剛開始從事生物監(jiān)測工作，種類鑒定、計數(shù)的速度相對較慢，而當(dāng)浮游生物計數(shù)框中的樣品液體蒸發(fā)減少時，則需要停止計數(shù)，大多數(shù)人很難完成《第四版》中要求的三條（即30個格），而由于樣品在計數(shù)框中的分布不均勻，需要計數(shù)在計數(shù)框不同位置格子的樣品數(shù)量，因此，在長期鑒定計數(shù)中，推薦對計數(shù)框中的樣品按照對角線的格進(jìn)行計數(shù)（如圖42b所示），，共計數(shù)30個小格。生物監(jiān)測一般需要計數(shù)每一個分類單位的數(shù)量，用劃“正”字的方法，每劃代表一個個體，以此記錄每個分類單位的個體數(shù)，同時建議每一個小格單獨(dú)計數(shù)，以便計算種類的出現(xiàn)頻率。（3）硅藻的計數(shù)若需要對硅藻樣品進(jìn)行生態(tài)學(xué)分析，可在硅藻封片中計數(shù)300～500個硅藻殼面（羽紋綱硅藻一個完整的藻體由兩個殼面組成，中心綱硅藻鏈狀由兩個殼面組成），計算每個種類的相對豐度，以此分析群落組成情況。 結(jié)果計算式中，n——單位面積藻類個體數(shù)量，ind/cm2； ni——抽樣的總個體數(shù)量，ind； V——抽樣體積，mL； Vi——定容總體積，mL； S——采樣總面積，cm2。 結(jié)果記錄鑒定記錄表格以及最終的數(shù)據(jù)統(tǒng)計表格參見附表1011。5 質(zhì)量保證與質(zhì)量控制 野外質(zhì)量保證與控制 樣品的采集 （1）保證所有野外設(shè)備處于良好的運(yùn)行狀態(tài)，須制定一項(xiàng)常規(guī)檢查、維護(hù)及/或校準(zhǔn)的計劃，以確保野外數(shù)據(jù)的異質(zhì)性和質(zhì)量。野外數(shù)據(jù)必須完整、規(guī)范、清晰。（2）合理安排各類生物樣品采集順序，盡量避免生物類群在采集前受到較大擾動。（3）定量采樣應(yīng)在定性采樣前進(jìn)行。（4）正確填寫樣品標(biāo)簽，包括樣品編號、日期、水體名稱、采樣位置以及采集人姓名。樣品記錄表包含的信息必須與樣品瓶標(biāo)簽相同。（5）及時清洗所有接觸過樣品的采樣設(shè)備，并仔細(xì)檢查，防止采樣污染。（6）及時在現(xiàn)場處理樣品。受生物活動影響，隨時間變化明顯的項(xiàng)目應(yīng)在規(guī)定時間內(nèi)測定。 樣品的保存按照要求分別保存各類樣品，保存時，每隔幾周檢查固定液，必要時進(jìn)行添加。 樣品的運(yùn)輸（1）必須根據(jù)采樣記錄或登記表核對清點(diǎn)樣品，以免有誤或丟失。（2）樣品運(yùn)輸中貯存溫度不超過采樣時的溫度，必要時需準(zhǔn)備冷藏設(shè)備。（3）運(yùn)輸中應(yīng)仔細(xì)保管樣品，以確保樣品無破損、無污染。應(yīng)避免強(qiáng)光照射及強(qiáng)烈震動。 采樣記錄除了樣品相關(guān)信息，采樣時間、地點(diǎn)、水溫、氣溫、水文、植被等也應(yīng)有詳細(xì)