【文章內(nèi)容簡介】 致蛋白質(zhì)分子聚集沉淀的原理進(jìn)行分離的。硫酸銨因價(jià)廉、溶解度大，且能使蛋白質(zhì)的性質(zhì)保持穩(wěn)定而成為最常用的鹽析劑。（6） 透析透析是利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜，而使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)分開的方法。透析通常不作為純化酶的一種單元操作，但通過透析可除去酶液中的鹽類、有機(jī)溶劑、低分子量抑制劑等，所以它在純化過程中極為常用。透析膜的截留極限一般在分子量5 000 左右，而Cu/Zn SOD的分子量遠(yuǎn)高于此，因此適合于透析法。（7） 膜分離技術(shù)膜分離技術(shù)采用了能選擇地透過一種物質(zhì)，而阻礙另一種物質(zhì)透過的具有特定性質(zhì)的半透膜，它的實(shí)質(zhì)是利用物質(zhì)經(jīng)過膜的傳遞速度不同而使其得以分離。 SOD的檢測(cè)我們通過測(cè)定SOD的酶活性，檢測(cè)SOD。氧化物歧化酶（SOD）的催化底物是O2 ，一般多以一定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物生成量或底物的消耗量作為酶活性單位。由于O2 自身很不穩(wěn)定，且不易制備，測(cè)定SOD的方法除少數(shù)采用直接法外，一般多為間接法。常用的有：⑴ 鄰苯三酚自氧化法即改良Marklund法。原理是基于經(jīng)典的分光光度法，在堿性條件下，鄰苯三酚自氧化成紅桔酚，用紫外可見光譜跟蹤波長為325nm、420nm或650nm（經(jīng)典為420nm），同時(shí)產(chǎn)生O2 ，SOD催化O2 發(fā)生歧化反應(yīng)從而抑制鄰苯三酚的自氧化，樣品對(duì)鄰苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映樣品中的SOD含量。本法具有特異性強(qiáng)，所需樣本量少（僅50μl），操作快速簡單，重復(fù)性好，靈敏度高，試劑簡單等優(yōu)點(diǎn)。⑵ 細(xì)胞色素C還原法（McCord法）原理是黃嘌呤黃嘌呤氧化酶體系中產(chǎn)生的O2 使一定量的氧化型細(xì)胞色素C還原為還原型細(xì)胞色素C，后者在550nm有最大光吸收。在SOD存在時(shí)，由于一部分O2 被SOD催化而歧化，O2 還原細(xì)胞色素C的反應(yīng)速度則相應(yīng)減少，即其反應(yīng)受到抑制。將抑制反應(yīng)的百分?jǐn)?shù)與SOD濃度作圖可得到抑制曲線，由此計(jì)算樣品中SOD活性。本法是間接法中的經(jīng)典方法，但本法靈敏度較低。(3)化學(xué)發(fā)光法原理黃嘌呤氧化酶在有氧條件下，催化底物黃嘌呤或次黃嘌呤發(fā)生氧化反應(yīng)生成尿酸，同時(shí)產(chǎn)生O2。后者可與化學(xué)發(fā)光劑魯米諾反應(yīng)，使其產(chǎn)生激發(fā)。SOD能清除O2 從而抑制魯米諾的化學(xué)發(fā)光。本法可應(yīng)用于SOD的微量測(cè)定，不僅靈敏度高，簡便易行，而且特異性與準(zhǔn)確性至少與細(xì)胞色素C還原法類似。(4)電泳法電泳染色定位法的基本原理是根據(jù)光化學(xué)法與NBT還原法。電泳則采取垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳。既可采用SOD活性正染色（呈現(xiàn)棕色區(qū)帶）也可采取SOD活性負(fù)染色（呈現(xiàn)無色透明區(qū)帶）。根據(jù)凝膠上電泳分離的SOD區(qū)帶的著色深淺與面積大小，對(duì)樣品進(jìn)行半定量分析，也可制作校正曲線計(jì)算樣品中的SOD含量。染色定位法常用于鑒定SOD，很少為了定量，主要原因是它不及化學(xué)法簡便，但鑒定SOD卻較化學(xué)法為優(yōu)。用電泳法可鑒定SOD是否摻有雜質(zhì)蛋白，有無同工酶，且可半定量地確定SOD的活性大小。 SOD的制備（1）實(shí)驗(yàn)原理SOD廣泛存在于各種生物體內(nèi)，迄今為止人們已從各種動(dòng)物臟器、血液、原生動(dòng)物、植物、昆蟲、藻類、細(xì)菌、真菌等各種生物組織中成功分離得到了SOD。我們這次利用大蒜制取SOD。大蒜蒜瓣和懸浮培養(yǎng)的大蒜細(xì)胞中含有豐富的SOD，通過組織或細(xì)胞破碎后。再用氯仿乙醇混合液去除雜蛋白，再用鹽析法和有機(jī)溶劑法兩種方法分離出SOD沉淀。（2）實(shí)驗(yàn)原料、試劑、器材與儀器實(shí)驗(yàn)原料：大蒜蒜瓣實(shí)驗(yàn)試劑：石英砂、磷酸緩沖液（,)、氯仿乙醇混合液、固體硫酸銨、連苯三酚、K2HPO4KH2PO4緩沖液器材與儀器：離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、研缽、離心管、玻璃棒、托盤天平等（3）操作步驟整個(gè)過程在05℃條件下進(jìn)行① SOD酶的提取：稱取5克大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎細(xì)胞后，、繼續(xù)研磨20min，使SOD酶充分溶解到緩沖溶液中，然后6000rpm冷凍離心15min，棄沉淀，取上清液。② 去除雜蛋白：，6000rpm離心15min，棄去沉淀，得到的上清液即為粗酶液。③ SOD的沉淀分離：粗酶液在攪拌下緩慢加入固體硫酸銨至飽和濃度60％，持續(xù)攪拌15min，6000rpm離心15min，得到SOD酶沉淀。④ SOD的純化：、然后6000rpm冷凍離心15min，棄沉淀，取上清液，用凝膠Sephacryl S200進(jìn)行純化，然后超濾濃縮。⑤ 將濃縮液冷凍干燥后即得成品 SOD的檢驗(yàn)（1）檢驗(yàn)原理連苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O，生成帶色的中間產(chǎn)物。在自氧化過程的初始階段，黃色中間物的積累在滯后30~45s后就與時(shí)間成線性關(guān)系。在有SOD存在時(shí)由于它能催化O生成O2與H2O2,從而阻止了中間物的積累，通過計(jì)算就能求出SOD的活力。連苯二酚自氧化法測(cè)定酶活力，酶活力按下式計(jì)算：總活力（U）= 單位體積活力原液總體積比活力（U/mg）=單位體積酶液活力/單位體積酶活力單位定義：在25℃恒溫條件下，每毫升反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯酚自氧化率達(dá)50%的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。（2）檢驗(yàn)所需溶液的配制① ：25℃，用水稀釋至2000ml：（3）檢驗(yàn)步驟（即酶活力的測(cè)定）① 測(cè)定連苯三酚的自氧化速率，調(diào)節(jié)連苯三酚溶液用量，（177。）D/min，經(jīng)試驗(yàn)測(cè)得連苯三酚溶液用量為6μl② 樣品活性的測(cè)定 ，在25177?！娴暮銣厮≈斜?0min，然后加入在25177?！娴暮銣厮≈蓄A(yù)熱好的連苯三酚溶液6μl，迅速搖勻倒入1cm比色杯中，以空白管為參比，在325nm下，每隔30s測(cè)一次吸光值，連續(xù)記錄3min,調(diào)節(jié)樣液體積，（177。）D/min，記錄此時(shí)樣液體積。 卵磷脂屬于一種混合物，是存在于動(dòng)植物組織以及卵黃之中的一組黃褐色的油脂性物質(zhì)，卵磷脂是生物膜的重要組分,其構(gòu)成成分包括磷酸、膽堿、脂肪酸、甘油、糖脂、甘油三酸酯以及磷脂。卵磷脂被譽(yù)為與蛋白質(zhì)、維生素并列的“第三營養(yǎng)素”。 化學(xué)名稱：磷脂酰膽堿，簡稱：PC ，卵磷脂按照其純度的高低，一般分為 PC50、PC 60 、PC70、PC80、PC 90、PC95等產(chǎn)品形式。最高可以提純到98%，因?yàn)槠浼兌仍礁?，氧化性能越?qiáng)，越不易保存，故提純到98%的卵磷脂需要做氫化處理，然后保存。未經(jīng)過氫化處理的卵磷脂，一般要求在充氮的密封容器中。純凈的卵磷脂常溫下為一種無色無味的白色固體，由于制取或精制方法、儲(chǔ)存條件不同被氧化而呈現(xiàn)淡黃色至棕色。磷脂最早是由Uauquelin于1812年從人腦中發(fā)現(xiàn)，Golbley于1844年從蛋黃中分離出來，并于1850年按照希臘文lekithos（蛋黃）命名為Lecithin（卵磷脂）,所以又稱為蛋黃素，并以希臘文命名為Lecithos（卵磷脂）。蛋黃中含有豐富的卵磷脂，牛奶、動(dòng)物的腦、骨髓、心臟、肺臟、肝臟、腎臟以及大豆和酵母中都含有卵磷脂。其中又以屬蛋黃、大豆和動(dòng)物肝臟的含量最高，雞蛋中的卵磷脂品質(zhì)最高，但是難以提取，這使得其價(jià)格堪與黃金相媲美。（1）人體營養(yǎng)需要人體所需的外源性膽堿90%是由卵磷脂提供，當(dāng)膳食膽堿不足時(shí)，體內(nèi)尚存卵磷脂的內(nèi)源資源即也可補(bǔ)充人體需要（2）對(duì)血清脂質(zhì)的調(diào)節(jié)作用調(diào)節(jié)血清脂質(zhì)水平意味著能降低膽固醇水平，保護(hù)肝臟，也能改善記憶力，加強(qiáng)免疫力以及抗脂肪肝的活力。（3）有助于胞囊纖維變性時(shí)對(duì)脂肪的吸收胞囊纖維變性是一種外分泌腺失調(diào)，一般都是因?yàn)轶w內(nèi)脂質(zhì)有限，胰脂酶，膽汁鹽和碳酸氫鈉存量不足引起。胞囊纖維變性嚴(yán)重影響脂肪的吸收，攝入脂肪有30%60%吸收不良，因而會(huì)造成脂肪痢。溶血磷脂酰膽堿能使攝入脂肪移位，將甘油一酯及脂肪酸在低共熔基質(zhì)中相結(jié)合。在有碳酸氫鈉離子及膽汁鹽情況下，變得容易吸收。（4）健康心臟證實(shí)卵磷脂對(duì)心臟健康有積極作用，因?yàn)樗苷{(diào)節(jié)膽固醇在人體內(nèi)的含量、有效降低膽固醇、高血脂及冠心病的發(fā)病率。（5）有益大腦，增強(qiáng)記憶力，延緩衰老腦神經(jīng)細(xì)胞中卵磷脂的含量約占其質(zhì)量的17%20%。卵磷脂的充分供應(yīng)保證充分的“膽堿”與人體內(nèi)的“乙酰”合成為“乙酰膽堿”，“乙酰膽堿”是大腦內(nèi)的一種信息傳導(dǎo)物質(zhì)，腦部的神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)（乙酰膽堿）減少是引起老年癡呆的主要原因，補(bǔ)充卵磷脂能提高腦細(xì)胞的活性化程度，提高記憶與智力水平。長期補(bǔ)充卵磷脂可以減緩記憶力衰退的進(jìn)程，預(yù)防或推遲老年癡呆的發(fā)生。(6)滋潤皮膚卵磷脂是人體每一個(gè)細(xì)胞不可缺少的物質(zhì)，如果缺乏，就會(huì)降低皮膚細(xì)胞的再生能力。卵磷脂是一種天然的解毒劑，它能分解體內(nèi)過多的毒素，并經(jīng)肝臟和腎臟的處理排出體外，正常人體內(nèi)含有許多毒素，特