【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 第九章 生物堿分析異喹啉衍生物類(lèi): 黃連、罌粟、吐根、 錫生藤、延胡索、防已、石蒜 吲哚衍生物類(lèi)： 番木鱉、毒扁豆、 麥角、蘿芙木莨菪烷衍生物類(lèi)：古柯、顛茄、洋金花胺類(lèi)堿性的強(qiáng)弱與取代氫的烴基種類(lèi)和數(shù)量有關(guān):1）在氨分子中一個(gè)氫原子被脂肪烴基取代后，因?yàn)橹緹N基是斥電子基，所以取代后使氮原子周?chē)碾娮釉泼芏仍龃螅娯?fù)性增強(qiáng)，吸引質(zhì)子能力加大，堿性也就加強(qiáng)了，其強(qiáng)度： 叔胺 ＞ 仲胺 ＞ 伯胺 ＞ 氨 2）季胺堿由于以離子形式存在，因此堿性更強(qiáng)3）N原子以酰胺形式存在時(shí)，堿性幾乎消失3．溶解度游離生物堿極性較??；能溶于乙醇、氯仿、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑，不溶或難溶于水。 生物堿的鹽類(lèi)多極性較大，尤其是無(wú)機(jī)酸鹽和小分子有機(jī)酸鹽多易離子化，生成帶正電荷的生物堿陽(yáng)離子，不溶或難溶于苯、氯仿、乙醚等。 生物堿和其鹽類(lèi)的性質(zhì)在這一點(diǎn)是相反的。這種性質(zhì)可以用于生物堿的提取、分離與精制。生物堿的無(wú)機(jī)酸鹽雖易溶于水，但溶解度的大小有區(qū)別。一般以含氧酸，如硫酸、磷酸等的鹽，水溶度較大。少數(shù)化合物的鹽酸鹽、氫碘酸鹽則難溶于水（如鹽酸小檗堿）。 4．常用的生物堿試劑有：碘碘化鉀（Wagner試劑）、碘化鉍鉀（Dragendorff試劑）、碘化汞鉀（Mayer試劑）、硅鎢酸（Bertrand試劑）等。 生物堿大都能溶于氯仿、甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，除季胺堿和一些分子量較低或含極性基團(tuán)較多的生物堿外，一般均不溶或難溶于水，而生物堿與酸結(jié)合成鹽時(shí)則易溶于水和醇?；谶@種特性，可用不同的溶劑將生物堿從中藥中提出。 1）萃取法 是利用游離生物堿及其鹽的溶解度的差別而達(dá)到精制目的。2）色譜法3）離子對(duì)方法4）超臨界流體萃取法 該法操作簡(jiǎn)單、快速、萃取效果可與索氏提取法相媲美，樣品可提取完全，而且萃取液不經(jīng)過(guò)濾就可直接進(jìn)樣分析，對(duì)不穩(wěn)定成分的測(cè)定更顯其優(yōu)越性。 （一）化學(xué)定性分析1）沉淀反應(yīng)： 中藥樣品細(xì)粉用水或稀酸溶液溫浸，濾液滴加下列沉淀試劑，應(yīng)有3種以上試劑顯陽(yáng)性反應(yīng)。氨基酸和蛋白質(zhì)在此條件下常有干擾，必要時(shí)通過(guò)薄層分離或?qū)V液堿化后，氯仿或乙醚提取，提取物溶于稀酸溶液進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，應(yīng)顯陽(yáng)性反應(yīng)。 2）常用的沉淀試劑（1）碘化汞鉀試劑（Mayer），生成白色或黃色沉淀。（2）碘化鉍鉀試劑（Dragendorff），生成橙色沉淀。（3）碘碘化鉀試劑（Wagner），生成褐色至暗褐色沉淀。 （4）磷鉬酸試劑（Sonnenschein），酸性溶液中生成白色或黃色沉淀，加入氨水變成藍(lán)色。（5）苦味酸試劑（Mager），微酸性溶液中生成黃色沉淀。（6）雷氏銨鹽試劑（Ammonium reineckate），酸性溶液和稀醇液中生成紅色無(wú)定性沉淀。（二）薄層色譜定性分析 1）常用的生物堿展開(kāi)系統(tǒng)：（1）甲苯乙酸乙酯二乙胺（7：2：1）：適用于多種生藥中生物堿的分離，初篩用（2）乙酸乙酯甲酸水（100：：10）：適用于水溶性生物堿（3）氯仿二乙胺（9：1）、氯仿甲醇（9：1，氨蒸氣飽和）、氯仿甲醇氨水（5：：6d）：適用于叔胺堿（4）正丁醇冰醋酸水（7：1：2）：適用于季胺堿2）吸附劑 吸附劑本身的酸堿性可影響生物堿的分離。硅膠本身略帶酸性，對(duì)生物堿的吸附力較強(qiáng)，用中性溶劑展開(kāi)時(shí)Rf值很小，有時(shí)斑點(diǎn)出現(xiàn)拖尾，若用堿性展開(kāi)劑．則可得到集中的斑點(diǎn)，因此，用硅膠為吸附劑分離生物堿時(shí)，可在中性展開(kāi)劑中加入少量堿如二乙胺或氫氧化銨等。 可在涂鋪硅膠薄層時(shí)用稀堿溶液使成堿性硅膠薄層，用中性展開(kāi)劑分離生物堿。堿性氧化鋁因本身帶堿性，故用中性展開(kāi)劑即可使生物堿很好的分離。3）顯色劑 碘化鉍鉀試劑是最通用的生物堿顯色劑，但它與植物中一些非生物堿物質(zhì)如蛋白質(zhì)、氨基酸、某些苷、糖、嘌呤、甲基化胺、鞣質(zhì)及銨鹽等特別是具有共軛羰基（酮或酸）或內(nèi)酯的非含氮物質(zhì)如香豆素、黃酮、查耳酮、強(qiáng)心苷產(chǎn)生正反應(yīng)而被誤認(rèn)為生物堿，干擾檢出。這些產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)的雜質(zhì)須用凈化生物堿的方法而除去。 8. 生物堿定量分析 一．比色法 （一）酸性染料比色法本法測(cè)定的主要條件：（1）介質(zhì)的pH。最為關(guān)鍵（2）酸性染料的種類(lèi)（3）有機(jī)溶劑的選擇二．薄層色譜法 三．高效液相色譜法 （1）離子交換 HPLC（2）反相HPLC 改善分離效果方法：1） 采用封端的固定相（游離硅醇基越少越好）2）使用堿性的流動(dòng)相: 為了減少生物堿在反相固定相上的拖尾，可以使用堿性流動(dòng)相，但是，化學(xué)鍵合相的穩(wěn)定性又限制了流動(dòng)相的pH值不能超過(guò)8。為了克服HPLC拖尾現(xiàn)象，通常在流動(dòng)相中加入堿，又稱(chēng)離子抑制劑。生物堿的HPLC分析中，碳酸銨、醋酸鈉、磷酸鈉均是常用的離子抑制劑。離子對(duì)反相色譜在生物堿的分離方面的應(yīng)用已證明是非常成功的，它允許生物堿的分離在酸性條件下進(jìn)行，于是就避免了堿性化合物在酸性硅醇基上的化學(xué)吸附問(wèn)題。 于流動(dòng)相中加入低濃度的長(zhǎng)鏈銨可使所分析的堿性化合物的色譜峰變得完美。3） 在流動(dòng)相中加入緩沖液也能改善分離效果，如磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液等。（3）離子對(duì)HPLC（4）正相色譜因?yàn)楣枘z上弱酸性的硅醇基的存在，為了避免化學(xué)吸附所造成的拖尾，常常在溶劑中加入堿性改善劑如氨、二乙胺、三乙胺，類(lèi)似于TLC分析系統(tǒng)，但是在堿性條件下硅膠G的穩(wěn)定性較差，硅膠G的溶解速度與堿性改善劑及有機(jī)溶劑的性質(zhì)有關(guān)。這樣就限制了硅膠G作固定相的HPLC在分析生物堿方面的應(yīng)用。對(duì)某些溶劑系統(tǒng)而言，柱壽命極短，甚至只有幾天。 一. 黃連的質(zhì)量分析 (P306)三．延胡索的質(zhì)量分析 (P310) 第十章 皂苷分析 1)甾體皂苷元多數(shù)無(wú)共軛系統(tǒng)，因此在近紫外區(qū)無(wú)明顯吸收峰，但與濃硫酸作用后，則在220600nm范圍內(nèi)出現(xiàn)最大吸收峰，可以作為甾體皂苷定性、定量分析的依據(jù)。2)甾體皂苷類(lèi)成分大部分集中在單子葉植物的百合科、薯蕷科、龍舌蘭科、延齡草科、菝契科（后二科在有的分類(lèi)系統(tǒng)中也歸于廣義的百合科中）；雙子葉植物僅少數(shù)種屬中有分布。含有甾體皂苷的常用中藥有穿山龍、綿萆薢、粉萆薢、重樓、土茯苓、知母、麥冬、天冬等。其中在雙子葉植物分布較為普遍，含三萜皂苷植物較多的科有五加科、傘形科、夾竹桃科、蘿藦科、菊科、石竹科、葫蘆科、大戟科、豆科、桃金娘科、遠(yuǎn)志科、毛茛科、薔薇科、茜草科等；許多常用的中藥含有三萜皂苷，如人參、三七、甘草、地榆、款冬花、酸棗仁、紫菀、桔梗、柴胡、遠(yuǎn)志、黃芪、威靈仙、商陸、白頭翁等。 3．常用的皂苷顯色反應(yīng) P319（1）醋酐 硫酸反應(yīng)（LibermannBurchard反應(yīng)）（2）三氯醋酸反應(yīng)（RosenHeimer反應(yīng)）（3）氯仿 濃硫酸反應(yīng)（Salkowski反應(yīng)）（4）冰醋酸一乙酰氯反應(yīng)（Tschugaefb反應(yīng)）（5）五氯化銻反應(yīng)（Kahlenberg反應(yīng)）（6）與苯肼反應(yīng)（7）芳香醛硫酸或高氯酸反應(yīng) 一、化學(xué)定性分析（一）顯色反應(yīng)皂苷類(lèi)化合物常見(jiàn)的顯色反應(yīng)有：醋酐 硫酸反應(yīng)、三氯醋酸反應(yīng)、氯仿 濃硫酸反應(yīng)、冰醋酸 乙酰氯反應(yīng)、苯肼反應(yīng)、芳香醛 硫酸或高氯酸反應(yīng)等。（二）泡沫反應(yīng)取含皂苷類(lèi)成分中藥粉末1g，加水10m1，煮沸10min后過(guò)濾，將濾液于試管內(nèi)強(qiáng)烈振搖，如產(chǎn)生持久性泡沫（15min以上）即為陽(yáng)性反應(yīng)。 (一)薄層條件1．吸附劑皂苷進(jìn)行薄層色譜分析所用的吸附劑主要有硅膠和氧化鋁，有時(shí)為了分離的需要加入一定的硝酸銀。用硝酸銀處理的硅膠（或氧化鋁）薄層，對(duì)具有相似極性、但在分子中帶有不同數(shù)目的雙鍵或雙鍵位置不同的化合物能夠開(kāi)。 2．展開(kāi)劑皂苷的極性較大，一般用分配薄層效果較好，親水性強(qiáng)的皂苷一般要求硅膠的吸附活性較弱一些，展開(kāi)劑的極性要大些，才能得到較好的效果。常用的溶劑系統(tǒng)有：氯仿 甲醇 水（65：35：10，下層）、正丁醇 醋酸 水（4：1：5，上層）等3．顯色劑薄層色譜時(shí)，皂苷常用的顯色劑有三氯醋酸、氯磺酸 醋酸、濃硫酸或50%及20%硫酸、三氯化銻、磷鉬酸、濃硫酸 醋酸酐、碘蒸氣等。這些顯色劑在應(yīng)用上各有優(yōu)缺點(diǎn)（1）25%磷鉬酸乙醇溶液（2）硫酸 甲醇（1：1）（3）氯磺酸 醋酸（1：2）溶液（4）碘蒸氣二．比色法 皂苷類(lèi)成分如加入適當(dāng)?shù)娘@色劑，使其呈色，可在可見(jiàn)光區(qū)進(jìn)行測(cè)定，這種測(cè)定方法是測(cè)定樣品中總皂苷或總皂苷元的含量。皂苷類(lèi)成分顯色反應(yīng)的專(zhuān)屬性一般較差，但反應(yīng)比較靈敏，方法簡(jiǎn)便，易行。所用顯色劑多為強(qiáng)氧化性的強(qiáng)酸試劑，皂苷與這些強(qiáng)酸試劑發(fā)生氧化、脫水、脫羧、縮合等一系列化學(xué)反應(yīng)，生成具多烯鍵結(jié)構(gòu)的縮合物而顯色。常用的顯色劑有濃硫酸，高氯酸、醋酐 硫酸、芳香醛 硫酸等。 三．高效液相色譜法 現(xiàn)今蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）的應(yīng)用使得皂苷類(lèi)成分的分析更為便利。ELSD是一種通用型檢測(cè)器，流動(dòng)相由熱氣流使之熱氣化噴霧，再進(jìn)入加熱管，溶劑在此揮發(fā)。所得分析檢測(cè)的物質(zhì)顆粒通過(guò)一狹窄光束散射光，由光電倍增管收集。ELSD的響應(yīng)取決于被分析物質(zhì)顆粒的數(shù)量和大小。由于ELSD僅對(duì)不揮發(fā)被分析物質(zhì)產(chǎn)生響應(yīng)，即使是在梯度洗脫時(shí)也能提供平穩(wěn)的基線(xiàn)。 一．人參的質(zhì)量分析 P333二．甘草的質(zhì)量分析 P336三．黃芪的質(zhì)量分析 P338四．重樓的質(zhì)量分析 P340第十一章 黃酮分析 1)黃酮類(lèi)成分的基本母核可以認(rèn)為是2苯基色原酮凡具C6C3C6結(jié)構(gòu)的成分被廣義稱(chēng)為黃酮類(lèi)成分2)黃酮類(lèi)成分在自然界的分布規(guī)律可歸納為 P3442. 顏色黃酮類(lèi)成分顏色與分子中是否存在交叉共軛體系、助色團(tuán)的數(shù)目及取代基位置有關(guān)。色原酮是無(wú)色的，當(dāng)吡酮環(huán)上第2位引入苯基后，就形成了色原酮與芳香環(huán)共軛的體系，構(gòu)成了生色團(tuán)的基本結(jié)構(gòu)，所以大多數(shù)黃酮類(lèi)成分呈黃色。黃酮類(lèi)成分的顏色隨共軛體系的增加及助色團(tuán)（OH、OCH3等）的數(shù)量的增多而加深。黃酮、黃酮醇、查耳酮、橙酮顯典型的黃色。醇羥基的數(shù)目和結(jié)合位置對(duì)顯色有較大的影響。1）OH數(shù)目越多，顯色越深。2）在色原酮的苯環(huán)（A環(huán)）上的OH（如5，7位）。對(duì)顯色影響小3）而位于B環(huán)上的OH（3`，4`位），對(duì)顯色影響大，顯深黃色；4）3位OH（黃酮醇）能使黃酮呈灰黃色；5）C2 ，C3為單鍵時(shí)，A，B環(huán)不再是共軛體系（二氫黃酮、二氫黃酮醇），呈無(wú)色。而異黃酮因共軛較少，而呈微黃色或無(wú)色。6）花青素及其苷的顏色，因pH而異。一般在酸性條件下呈紅色；pH8左右呈紫色；堿性條件（pH11以上）呈藍(lán)色。3. 酸堿性（1）1位的氧原子具有未共用電子對(duì)而呈弱堿性，能與強(qiáng)酸成鹽。（2）分子中大多具酚羥基，因此具有弱酸性，可以與強(qiáng)堿形成水溶性的鹽，這一性質(zhì)常被用于黃酮類(lèi)化合物的分離。 1）與金屬離子的絡(luò)合鋁鹽：常用試劑為1%三氯化鋁或硝酸鋁溶液，生成的絡(luò)合物為黃色，并有熒光。鋯鹽：多用2%二氯氧化鋯甲醇液，生成黃色的絡(luò)合物鉛鹽：常用1%醋酸鉛及堿式醋酸鉛水溶液，生成黃紅色沉淀鎂鹽：常用醋酸鎂甲醇液，二氫黃酮、二氫黃酮醇類(lèi)可顯天藍(lán)色熒光。而黃酮、黃酮醇及異黃酮類(lèi)等則顯黃—橙黃褐色2)還原反應(yīng) （1）鹽酸 鎂粉反應(yīng) 檢查黃酮、黃酮醇及其二氫化合物（2）鹽酸 鋅粉反應(yīng) 檢查二氫黃酮醇（3）鈉汞齊反應(yīng) 檢查黃酮（4）四氫硼鈉（鉀）反應(yīng) 檢查二氫黃酮醇3)其它顯色反應(yīng) （1）酚羥基顯色反應(yīng)（2）堿性溶劑反應(yīng)（3）與濃硫酸反應(yīng) （4）與硼酸反應(yīng) 黃酮類(lèi)成分有兩個(gè)比較強(qiáng)的吸收峰：第1吸收峰位于300400nm，稱(chēng)為Ⅰ帶，它是由于B環(huán)的桂皮?；鸬?。第2吸收峰位于240285nm，稱(chēng)之為Ⅱ帶，它是由于A環(huán)的苯甲?；鸬?。不同類(lèi)型黃酮的最大吸收（nm）1）黃酮， I帶：304350，II帶：2502702）黃酮醇， I ：358385， II ：2502703）二氫黃酮，I：310330（吸收弱）II ：2752904）異黃酮， I：無(wú)吸收， II：2502705）查耳酮， I：360390 II：240260（吸收弱）：一些常用的位移試劑如三氯化鋁、醋酸鈉、甲醇鈉、硼酸硼酸鈉可使黃酮類(lèi)成分的最大吸收的選擇性與靈敏度有所提高，而且還可以消除雜質(zhì)的干擾，有利于含量測(cè)定。 一、化學(xué)定性分析1．鹽酸 鎂粉反應(yīng)（1）槐花的鑒別 ，加乙醇10ml，加熱5min，濾過(guò)。取濾液1ml，加鎂粉少量與鹽酸23滴，即顯櫻紅色。 2．四氫硼鉀反應(yīng)3. 三氯化鋁反應(yīng)野菊花的鑒別：取野菊花粉末3g，加乙醇40ml，加熱回流1h，濾過(guò)，取濾液1滴，點(diǎn)于濾紙上，噴灑三氯化鋁試液，晾干，置紫外光燈下（365nm）下觀察，顯黃綠色熒光。 二、色譜定性分析