實(shí)驗(yàn)課-制藥工程生化原理與制備實(shí)驗(yàn)指doc(編輯修改稿)
2025-08-11 04:38 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 1 M Tris?Cl (pH ) ml SDS （電泳級） g 溴酚藍(lán)（BPB）25 mg 甘油 ml b．加去離子水溶解后定容至5 ml。 c．小份（500 ul/份）分裝后于室溫保存。 d．使用前將25 ul的2ME加到每小份中。 e．加入2ME的樣品溶解液可在室溫下保存一個(gè)月左右。3) 凝膠貯液稱Acr30g，加重蒸水至100ml，過濾后置棕色瓶內(nèi)，4℃貯存可用1—2個(gè)月。4) 凝膠緩沖液 。4℃貯存，用前稍加溫使SDS溶解。5) 1%TEMED取TEMED1ml，加重蒸水至100ml，置棕色瓶內(nèi)4℃貯存。6) 10%過硫酸銨（AP）稱AP10g，加重蒸水100ml，置棕色瓶內(nèi)4℃貯存。7) 電極緩沖液（%SDS，）：稱SDS1克，再用蒸餾水定容至1L。8) 2%瓊脂（糖）粉稱瓊脂（糖）2g，加100ml上述電極緩沖液，4℃貯存。4. 固定液取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻。5. 染色液 考馬斯亮藍(lán)R250 ，加上述固定液250ml，過濾后應(yīng)用。6. 脫色液冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1L。五、操作（一）安裝夾心式垂直板電泳槽夾心式垂直板電泳槽操作簡單，不易滲漏。這種電泳槽兩側(cè)為有機(jī)玻璃制成的電極槽，兩個(gè)電極槽中間夾有一個(gè)凝膠模，該模由1個(gè)凵形硅膠框、長與短玻璃板及樣品槽模板（梳子）所組成。電泳槽由上貯槽（白金電極在上或面對短玻璃板），下貯槽（白金電極在下或面對長玻璃板）和回紋冷凝管組成。兩個(gè)電極槽與凝膠模間靠貯液槽螺絲固定。各部分按下列順序組裝：1） 裝上貯槽和固定螺絲銷釘，仰放在桌面上。2） 將長、短玻璃板分別插到凵形硅膠框的凹形槽中。注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。3） 將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對上貯槽。4） 將下貯槽的銷孔對準(zhǔn)已裝好螺絲銷釘?shù)纳腺A槽，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽。5） 豎直電泳槽，用細(xì)長頭滴管吸取已熔化的2%瓊脂（糖）加在長玻璃板下端與硅膠框交界的縫隙內(nèi)，其目的是封住空隙，加瓊脂（糖）溶液時(shí)中應(yīng)避免有氣泡。（二）配膠及凝膠板的制備1. 配膠根據(jù)所測蛋白質(zhì)分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度。下表表示配制10ml不同濃度分離膠所需各種試劑用量（單位/ml）。SDSPAGE 分離膠配制方法2. 凝膠板的制備按表SDSPAGE分離膠配制方法配制10ml 10%濃度的膠，按SDSPAGE濃縮膠（5%Acrylamide）配方表配制5ml5%濃縮膠，再向兩塊玻璃板的縫隙內(nèi)加水，待分離膠凝固后，把水倒出，用濾紙把水吸干。再向兩塊玻璃板中間加入濃縮膠，插入梳子。凝膠聚合約需30min，小心拔出梳形樣品槽模板，用窄條濾紙吸去殘余水分，注意不要弄破凹形加樣槽的底面。倒入電極緩沖液即可準(zhǔn)備加樣。（三）加樣加樣體積要根據(jù)凝膠厚度及樣品濃度靈活掌握，一般加樣體積為10—15μL。如果樣品槽中有氣泡，可用注射器針頭挑除。加樣時(shí)，將微量注射器的針頭通過電極緩沖液伸入加樣槽內(nèi)，盡量接近底部，輕輕推動(dòng)微量注射器，注意針頭勿碰破凹形槽膠面。（四）電泳上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開電源，將電流調(diào)至20mA，待樣品進(jìn)入分離膠后，將電流調(diào)至60mA，待染料前沿遷移至距硅膠框底邊1—，停止電泳。（五）凝膠板剝離電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下硅膠框，用不銹鋼藥鏟撬開短玻璃板，在凝膠板切下一角作為前沿標(biāo)記。在兩側(cè)溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心，插入細(xì)銅絲作為前沿標(biāo)記。（六）染色與脫色先用固定液將凝膠固定1小時(shí)，再將染色液倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，染色40min左右，用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計(jì)算相對遷移率。（七）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線將大培養(yǎng)皿放在一張坐標(biāo)紙上，量出加樣端距細(xì)銅絲間的距離（cm）（即染料遷移距離）以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離（cm）（即樣品遷移距離），如圖所示。按下式計(jì)算相對遷移率mR：以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的相對遷移率為橫坐標(biāo)在半對數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測樣品相對遷移率可直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其分子量。 樣品及標(biāo)準(zhǔn)蛋白在連續(xù)SDSPAGE分離示意圖樣品槽1,2,4,5,為待測樣品，樣品槽3為標(biāo)準(zhǔn)蛋白六 注意事項(xiàng)1. SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例（即：），蛋白質(zhì)含量不可以超標(biāo)，否則SDS結(jié)合量不足。2. 有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（α胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量。3. 如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象，可能是SDS不純引起。思考題1. SDS—PAGE用于蛋白質(zhì)分子量測定的基礎(chǔ)
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