【文章內(nèi)容簡介】 得到PCR產(chǎn)物：使用下面過程擴(kuò)增重組桿粒DNA，適用M13正反引物和Platinum Taq酶。如果你使用M13F或M13 R與一個(gè)你的基因特意引物混合，你需要自己決定擴(kuò)增的條件。如果你使用其它的聚合酶，依照供應(yīng)商提供的建議。注意：如果你的插入片段＞4kb擴(kuò)增條件需要被優(yōu)化. 每個(gè)樣品，重組桿粒DNA（100ng） 1ul10XPCR Buffer 5ul 10mM dNTP Mix 5ul50mM MgCl2 PCR引物（） 蒸餾水 總體積 50ul 一滴礦物油覆蓋 一下參量進(jìn)行擴(kuò)增 從反應(yīng)產(chǎn)物吸取510ul進(jìn)行瓊脂糖電泳分析你將會看到：如果轉(zhuǎn)化發(fā)生了，而且你使用的是M13正負(fù)引物擴(kuò)增，你將會在電泳上看到下列PCR產(chǎn)物大小如果你使用的是M13 和你的特異引物進(jìn)行的擴(kuò)增，你需要決定PCR產(chǎn)物是否是希望的。12頁的圖有助于你計(jì)算。重組桿狀病毒的產(chǎn)生轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞：介紹：一旦你證明了你的重組桿粒含有你的目的基因，就可以準(zhǔn)備進(jìn)行昆蟲細(xì)胞的轉(zhuǎn)染了，以產(chǎn)生重組桿狀病毒。本章提供指導(dǎo)和建議以便完成昆蟲細(xì)胞的轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備質(zhì)粒：你可以使用任何方法準(zhǔn)備純化的重組桿粒DNA。桿粒DNA必須沒有酚和NaCl的污染，他們會殺死細(xì)胞，鹽類會干擾脂類復(fù)合物，降低轉(zhuǎn)染效率。我們推薦使用本公司產(chǎn)品提質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染方法：推薦使用一個(gè)陽離子脂質(zhì)體，例如Cellfectin試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。此試劑用來提供給表達(dá)系統(tǒng)使用。Cellfectin試劑：不做翻譯昆蟲細(xì)胞系：推薦使用Sf9 和Sf21進(jìn)行轉(zhuǎn)染。High Five? and Mimic? Sf9不推薦因?yàn)樗麄冝D(zhuǎn)染效率低下。不過，如果你有了你的桿狀病毒株，你可以進(jìn)行High Five? and Mimic? Sf9表達(dá)試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染介質(zhì)：為了高效的轉(zhuǎn)染，我們推薦在無Grace的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中完成轉(zhuǎn)染。注意Grace的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)該不含有FBS（血糖），因?yàn)榈鞍自谘呛推溲a(bǔ)充物中會與Cellfectin試劑互作，影響轉(zhuǎn)染。 注意：如果你在Sf900Ⅱ SFM中收獲了Sf9或Sf21，你可以在不含有Grace的培養(yǎng)基中完成轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后可以容易的將Sf900Ⅱ SFM轉(zhuǎn)變回去陽性對照：如果你有了從pFastBac對照質(zhì)粒中得到的重組桿粒，我們推薦，包括這個(gè)陽性對照在你的試驗(yàn)中和轉(zhuǎn)化中能夠評估你的結(jié)果。在這些桿粒中，包括β葡糖甘酶（Gus）和/或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）將會在PH或者P10啟動(dòng)子控制下表達(dá)。在轉(zhuǎn)染過后，表達(dá)的Gus和CAT可以適當(dāng)進(jìn)行驗(yàn)證。所需材料：開始之前需要有下列材料： *從pFastBacTM結(jié)構(gòu)（500ng/ul TE溶解，）中純化的重組桿粒DNA *從合適的pFastBacTM對照結(jié)構(gòu)中純化的重組桿粒DNA *合適培養(yǎng)基收獲的Sf9或者Sf21 *Cellfectin試劑（4度保存） *Grace`s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，未被補(bǔ)充的（培養(yǎng)基不含有補(bǔ)充劑，F(xiàn)BS或者抗生素） *6孔培養(yǎng)板或者其它組織 培養(yǎng)用具 *12X75mm滅菌管 *培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的完全培養(yǎng)基計(jì)算出你的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)所需的Sf9 細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)行擴(kuò)增。轉(zhuǎn)染前確定細(xì)胞健康且繁殖能力＞97%。轉(zhuǎn)染條件：我們通常使用下列條件在Sf9中擴(kuò)增桿狀病毒株。對于你的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)這些條件應(yīng)該作為一個(gè)起始點(diǎn)，你可以通過改變DNA和Cellfectin試劑的濃度以及細(xì)胞密度對條件進(jìn)行優(yōu)化。 轉(zhuǎn)染步驟：適用下列步驟在6孔板進(jìn)行Sf9 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。如果你想在其它細(xì)胞培養(yǎng)用具中轉(zhuǎn)染細(xì)胞，你需要對你的條件進(jìn)行優(yōu)化。記得使用無補(bǔ)充的Grace`s培養(yǎng)基，他不含有FBS或抗生素 在6孔板或35mm組織培養(yǎng)板，與每個(gè)孔2ml含有抗生素的培養(yǎng)基中（例如：2ml的SF900ⅡSFM包含50單位/ml青霉素和50ug/ml鏈霉素）接種9X105Sf9細(xì)胞。 27度細(xì)胞最少接觸1小時(shí) 對于每個(gè)轉(zhuǎn)染的樣品，準(zhǔn)備桿粒DNA：Cellfectin試劑混合在12X75mm的滅菌管中1） 將1ug純化的桿粒DNA稀釋進(jìn)入100ul未補(bǔ)充Grace培養(yǎng)基2） 完全混勻Cellfectin試劑，翻轉(zhuǎn)混合510次。吸出6ulCellfectin試劑稀釋進(jìn)100ul未補(bǔ)充Grace培養(yǎng)基。3） 使用稀釋的Cellfectin試劑連接稀釋的桿粒DNA（總體積約210ul）。輕混合，室溫?fù)嵊?545分鐘。 在DNA/脂肪混合體撫育過程中，從細(xì)胞中除去培養(yǎng)基并用2ml未補(bǔ)充Grace培養(yǎng)基清洗。棄去清洗培養(yǎng)基。 ，清混勻，將混合體加入到含有細(xì)胞的孔中。 27度培養(yǎng)5小時(shí) 棄去DNA/脂肪混合體，向細(xì)胞中加入2ml全培養(yǎng)基（例如SF900SFM含有抗生素） 27度潮濕條件撫育72小時(shí)或者指導(dǎo)你開始能夠看到病毒感染的現(xiàn)象。提取P1病毒株。分離P1病毒株介紹：帶有芽孢的病毒應(yīng)該在轉(zhuǎn)染以后釋放入培養(yǎng)基72小時(shí)。但是，如果你的轉(zhuǎn)染效率不好，細(xì)胞可能在轉(zhuǎn)染后的45天也沒有被病毒感染的跡象。轉(zhuǎn)染過后的72小時(shí)，你需要親自檢查細(xì)胞是否有感染信號（下表）一旦細(xì)胞出現(xiàn)感染，使用下列步驟從培養(yǎng)基中收獲細(xì)胞。感染細(xì)胞的特性：使用倒差顯微鏡在250400X觀察感染細(xì)胞時(shí)，可以看到病毒感染的細(xì)胞具有以下特點(diǎn)：感染記號顯性描述早期（第一個(gè)24小時(shí)）細(xì)胞直徑增加可以看到直徑增大了2550% 細(xì)胞核增大細(xì)胞核可能充滿細(xì)胞晚期（2472小時(shí)）細(xì)胞停止增長與單個(gè)細(xì)胞相比，細(xì)胞不再增大出現(xiàn)顆粒體病毒芽孢信號，出現(xiàn)小泡分離細(xì)胞從平板或曲頸瓶脫離很晚期（大于72小時(shí)）細(xì)胞消亡細(xì)胞出現(xiàn)消亡，單層細(xì)胞開始出現(xiàn)消亡制備P1病毒株：一旦從第8步得到轉(zhuǎn)染細(xì)胞，上述的晚期轉(zhuǎn)染現(xiàn)象出現(xiàn)，就可以從每個(gè)孔中收集含有病毒的細(xì)胞，并轉(zhuǎn)入滅過菌的15ml帶蓋管子。500Xg離心5分鐘除去細(xì)胞和大的碎片 將上清轉(zhuǎn)到新的15ml離心管。這就是P1病毒株。4度避光儲存。儲存信息見下頁 注意：如果你希望濃縮的病毒株，你可以在離心后。病毒株的儲存：按下列條件儲存： 避光，4度 如果培養(yǎng)基不含血清，加入FBS至終濃度為2%，血清可以作為蛋白酶底物。 對于長期保存，重新擴(kuò)增后保存整株病毒于80度 不要在4度時(shí)儲存經(jīng)常使用的病毒。重復(fù)凍融會降低病毒的滴度。下一步：得到你的純化P1桿狀病毒株之后，你可以： 擴(kuò)增毒株（下節(jié)詳細(xì)介紹）這個(gè)過程推薦得到最高滴度的毒株，而且在你的試驗(yàn)中優(yōu)化結(jié)果 決定你的毒株的滴定度（見病毒斑點(diǎn)試驗(yàn)） 如果你希望，純化你的病毒結(jié)構(gòu) 使用P1病毒株感染Sf9進(jìn)行表達(dá)預(yù)試驗(yàn)。注意：如果你想做一個(gè)小規(guī)模的或者是預(yù)試驗(yàn)，你可以直接使用P1毒株感染Sf9進(jìn)行表達(dá)試驗(yàn)。由于毒株數(shù)量小，表達(dá)條件可能不能再生（如果滴度未知，MOI是不可知的）擴(kuò)增你的病毒株介紹：P1毒株是小規(guī)模，低滴度的毒株，你需要使用這株去感染細(xì)胞，從而產(chǎn)生高滴度的P2株。轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞得到的首株的滴度一般為1X106到1X107pfu/ml。用以下步驟擴(kuò)增得到的P2株滴度為1X107到1X108pfu/ml。本章提供P2株的制備和指導(dǎo)所需材料：SF9或Sf21；P1病毒株；合適的培養(yǎng)用具；組織培養(yǎng)試劑；27度潮濕培養(yǎng)箱重要的：擴(kuò)增P1病毒株，需要感染Sf9或者Sf21 ，使用懸浮或單層培養(yǎng)。根據(jù)你的需要，你可以任何規(guī)模的擴(kuò)增，但是你因你使用的P1菌株的量受到限制。一般擴(kuò)增P1在10ml懸浮培養(yǎng)基中培養(yǎng)2X106細(xì)胞/ml或在6孔板培養(yǎng)2X106細(xì)胞/ml。計(jì)算感染所需的Sf9細(xì)胞，隨后Expand細(xì)胞。使用前確定你的細(xì)胞健康并且繁殖力大于97%多樣性感染（MOI）：為了擴(kuò)增毒株。MOI就像每個(gè)細(xì)胞的病毒數(shù)量一樣需要定義。使用下列公式計(jì)算獲得特定的MOI需要多少病毒株：注意：如果你沒有滴定你的P1毒株，你需要假定滴度范圍是1X106至107pfu/ml例如：需要感染10ml細(xì)胞，2X106細(xì)胞/ml，使用MOI = 毒株的滴度是5X106pfu/ml。擴(kuò)增步驟：依照下列步驟在6孔板擴(kuò)增P1毒株 感染當(dāng)天，準(zhǔn)備Sf9和Sf21細(xì)胞上清和細(xì)胞板，2X106細(xì)胞/孔。接觸培養(yǎng)細(xì)胞室溫1小時(shí) 1小時(shí)后倒差顯微鏡檢查細(xì)胞的吸附情況 每孔加入合適數(shù)量的P1毒株 27度潮濕培養(yǎng)箱撫育細(xì)胞48小時(shí) 感染后48小時(shí)，從每個(gè)孔收集2ml含有病毒的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)到15ml的管子。500Xg離心5分鐘棄去細(xì)胞和碎片。注意：可以在感染晚期收獲病毒（72小時(shí)）。每個(gè)桿狀病毒的結(jié)構(gòu)決定了優(yōu)化收獲時(shí)間。過度培養(yǎng)將會由于細(xì)胞的調(diào)亡使生殖能力衰減 將上清轉(zhuǎn)到15ml管子。這是P2毒株。4度避光保存。長期保存需要整株在80度 檢測你的P2毒株的滴度梯度擴(kuò)增步驟：一旦你有了高滴度的P2桿狀病毒毒株，你可以梯度增加擴(kuò)增病毒至任何體積。為了產(chǎn)生高滴度的P3，梯度擴(kuò)增的細(xì)胞量和病毒體積要適當(dāng)，遵照本章指導(dǎo)從冰凍的主毒株獲得高滴度毒株：如果你儲存你的毒株在80度，我們推薦使用此株產(chǎn)生另外的高滴度毒株進(jìn)行表達(dá)試驗(yàn)。當(dāng)病毒在80度保存時(shí)，滴度會降低。下面為指導(dǎo)和擴(kuò)增過程病毒斑點(diǎn)試驗(yàn)（Performing a Viral Plaque Assy）:介紹：我們推薦使用斑點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)行：決定你毒株的滴度；斑點(diǎn)純化病毒（可選）試驗(yàn)框架：決定病毒的滴度，你需要 在6孔板的Sf9細(xì)胞 準(zhǔn)備10flod連續(xù)稀釋的病毒株 將不同稀釋的桿狀病毒加入到Sf9 和感染細(xì)胞中1小時(shí) 棄去病毒覆蓋細(xì)胞層使用Plaquing培養(yǎng)基 撫育710天計(jì)算每個(gè)稀釋物中的斑點(diǎn)病毒滴度影響因素：影響滴度的因素很多： 目的基因的大小。滴度一般會隨著目的基因的增大而減小 轉(zhuǎn)染效率。為了高的轉(zhuǎn)染效率，