【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ic primers, and sorghum varieties – “HN 16” and Qian san F8 rebinant inbred lines for SSR polymorphism analysis, in order to observe the screen for 5 polymorphic primers sense of resistance in the munity, through the observation of the groups electrophoresis bands, and bining the survey of group feeling phenotypic resistance to find the traits and purpose in a chain of genes. Results show that the molecular markers used in the experiment with aphid resistant gene is chain. Key words: Sorghum bicolor；aphid resistance；SSR marker。 genetic analysis0引言【本實(shí)驗(yàn)意義】高粱作為世界上最重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量和質(zhì)量受到世界的關(guān)注和研究，它具有抗旱、耐澇及抗鹽堿等不良環(huán)境的特性。高粱蚜（Melanaphis sacchari）主要危害高粱又可危害甘蔗、小麥、大麥、玉米等作物，是一種間歇性發(fā)生的猖獗害蟲(chóng)，每34年突發(fā)一次。蚜蟲(chóng)除直接從植物體內(nèi)吸收營(yíng)養(yǎng)外，還大量分泌蜜露等物質(zhì)污染作物，影響了植物的光合作用，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。通過(guò)對(duì)高粱抗蚜性的鑒定，對(duì)高粱研究育種方面具有一定的指導(dǎo)性意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展介紹】2008年，常金華[2]等人通過(guò)對(duì)抗蚜的河農(nóng)16和感蚜品系Tx623B、Tx622B、Tx3197B、千三、晉五及雜交種的物理特性、組織結(jié)構(gòu)、生理生化特性的對(duì)比分析,研究了不同基因型高粱理化特性與抗蚜性的相關(guān)性。結(jié)果表明,高粱抗蚜品系葉片表面較感蚜品系的細(xì)胞排列整齊、致密、表皮細(xì)胞直徑較感蚜品系小、葉片薄、葉片表面光滑，并且在所有的供試材料中，感蚜前后抗蟲(chóng)和感蟲(chóng)品系的PAL酶存在規(guī)律性的變化。2010年，鄒劍秋等采用SSR技術(shù)，應(yīng)用分離群體分組分析法，分別利用恢復(fù)系分離群體（2381R／矮四）和保持系分離群體（Tx622B／7050B），篩選抗絲黑穗病菌3號(hào)生理小種基因的分子標(biāo)記，最后在所用的SSR引物中篩選出4個(gè)，位于B染色體上，Xtxp145位于I染色體上，%%，[3]。2010年，余傳漲等人采用自行開(kāi)發(fā)的52個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)41個(gè)高粱品種進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明, 52對(duì)SSR引物在3%瓊脂糖凝膠上共檢測(cè)出277個(gè)等位變異,平均每個(gè)位點(diǎn)有53個(gè)等位變異。通過(guò)聚類(lèi)分析將41個(gè)高粱品種分為2個(gè)類(lèi)群[8] ?！颈緦?shí)驗(yàn)切入點(diǎn)】分子標(biāo)記能在DNA水平上反映植物遺傳基礎(chǔ)的差異，是植物遺傳育種領(lǐng)域內(nèi)的一項(xiàng)新興技術(shù)。SSR（Simple Sequence Repeat,簡(jiǎn)單重復(fù)序列）是當(dāng)今四大分子標(biāo)記技術(shù)之一。簡(jiǎn)單序列重復(fù)( Simple sequence repeat , SSR) 又稱微衛(wèi)星( Microsatellite) , 它是基于PCR 基礎(chǔ)上的一種分子標(biāo)記, 最早在人類(lèi)基因組研究中發(fā)現(xiàn), 而后被應(yīng)用于植物、動(dòng)物等研究中。它是一種由15個(gè)核苷酸為重復(fù)單位串聯(lián)組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的序列[5]。與形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記這3種標(biāo)記比較，分子標(biāo)記具有準(zhǔn)確度比較高、信息量大、遺傳多態(tài)性高、穩(wěn)定性、重復(fù)性好等特點(diǎn)[6]。因此SSR標(biāo)記在基因組研究中廣泛地應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、比較基因組和系統(tǒng)研究中,同時(shí)也是在分子水平上研究遺傳多樣性的有力工具。近年來(lái)隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,高粱的利用價(jià)值被逐步發(fā)掘出來(lái), 廣泛用于飼料, 燃料乙醇, 制糖等產(chǎn)業(yè)。合理開(kāi)發(fā)利用高粱, 對(duì)我國(guó)糧食安全, 緩解能源危機(jī)具有重要意義。對(duì)高粱抗蚜性在分子方面的研究，一方面有助于高粱的產(chǎn)量的提高，另一方面，有利于緩解能源與糧食危機(jī)。【本實(shí)驗(yàn)的目的】本實(shí)驗(yàn)利用河農(nóng)16和千三的雜交組合，對(duì)高粱抗蚜性鑒定方法，抗性遺傳和SSR分子標(biāo)記等進(jìn)行了一些調(diào)查了解。其目的在于：了解高粱抗蚜性的遺傳鑒定方法，充分了解高粱抗蚜性的遺傳特點(diǎn)，建立一套適合高粱蚜抗性的SSR體系找到與高粱蚜抗性基因連鎖的分子標(biāo)記，為最終掌握高粱蚜抗性遺傳規(guī)律，克隆高粱蚜抗性基因奠定基礎(chǔ)。1材料和方法河農(nóng)16（ HN16） 來(lái)源于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)利用從優(yōu)質(zhì)雜交種NK22 的分離后代中獲得, 對(duì)高粱蚜表現(xiàn)免疫,是優(yōu)質(zhì)糧飼兼用型品種。千三( Q S) 由千晉紅和三尺三的雜交后代選育, 是河北農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的一個(gè)豐產(chǎn)性較好的恢復(fù)系, 但對(duì)高粱蚜表現(xiàn)高感。實(shí)驗(yàn)儀器：試管若干、錐形瓶、離心管、研缽、剪刀、水浴鍋、離心機(jī)等。藥品：硝酸銀、氫氧化鈉、 mmol/L NaCl，2% CTAB，1M ， PH ， mmol/L NaCl，氯仿:異戊醇（24:1）、無(wú)水乙醇、70％乙醇等。 DNA的提取通過(guò)使用CTAB法提取高粱葉片組織DNA，具體步驟如下：（1）CTAB提取緩沖液（2%CTAB，1M ， ， mmol/L NaCl，2％β巰基乙醇），65℃提前水?。患羧「吡蝗~片于研缽中加入800ulCTAB提取液研磨，℃水浴40min。（2）將離心管取出冷卻至室溫，加入等體積的氯仿:異戊醇（24:1），充分混勻，配平后10,000 rpm離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中。 （3）加入2倍體積的預(yù)冷過(guò)的無(wú)水乙醇，輕輕顛倒數(shù)次即可見(jiàn)成團(tuán)白色DNA絮狀沉淀析出(可以置于20℃放置30 min)，10,000 rpm離心10 min，棄上清。（4）加1 mL 70％乙醇進(jìn)行洗滌，10,000rpm離心5 min，重復(fù)本步驟2次。（5）去掉乙醇后室溫下風(fēng)干DNA，加入50ul的dd H2O使之完全溶解。（6）紫外分光分度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA完整性。 SSR擴(kuò)增 SSR引物序列見(jiàn)下表：引物名稱堿基序列（5`端到3`端）退火溫度/℃Sb6m3174FTAg Cgg ATT CAA TgT TgCSb6m3174RTCC ACA TCA TCT TCC ACA ASb6m3500FTCg TgC TgC TTg CCT TCASb6m3500RCCg AgC gTT gTT gTC TTC ASb6m3610FgAA AAg gTT gCT TCg TAASb6m3610RgAA CAT CCg TCC CAT AAASb6rj2880FATC gAg CCA TCC ATC TCA ACSb6rj2880RTgg TCg AAA TTT ACg AgA CAA AG5Q5FATT gACg TAC CgA TgT CTC TA55G5Q5RTCA gTC CAT AAA ACA TgT ACA g55本實(shí)驗(yàn)中SSR擴(kuò)增采用10μlPCR反應(yīng)體系。PCR體系（10μl）模板DNA 引物 10Buffer 1μlDNTP Taq酶 dd 水 μl反應(yīng)循環(huán)參數(shù)參照劉國(guó)慶[7]的方法，略作改動(dòng)：PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 5min, 循環(huán) 95℃變性 30s、退火1min、72℃延伸 2min, 共 35個(gè)循環(huán), 最后在 72℃延伸 10min。PCR產(chǎn)物用8%的凝膠工作液電泳分離, 銀染顯色（其8%的凝膠工作液和銀染試劑的配制見(jiàn)表2）。8%的凝膠工作液配制成分/溶液體積 20406080100超純水/ml 142842567010TBE/ml 24681040%貯液/ml 48121620TEMED/μl 2040608010010%AP/μl 2004006008001000