【文章內(nèi)容簡介】 97)已在小麥的ISSR標記研究中發(fā)現(xiàn)ISSR標記可獲得數(shù)倍于RAPD標記的信息量。由于ISSR標記不像RFLP標記一樣步驟繁瑣，且不需同位素標記，因此，針對重復序列含量高的物種，利用ISSR法可與RFLP，RAPD等分子標記相媲美。它對填充遺傳連鎖圖上大的不飽和區(qū)段，富集有用的理想標記具有重要意義。(五)其他標記1．CAPs(cleaved amplification polymorphism sequence—tagged sites)CAPs技術(shù)又稱為PCR—RFLP。用特異設(shè)計的PCR引物擴增目標材料時，由于特定位點的堿基突變、插入或缺失數(shù)很小，以至無多態(tài)性出現(xiàn)，往往需要對相應PCR擴增片段進行酶切處理，以檢測其多態(tài)性(Akopyanz等，1992)。其基本步驟是：先利用特定引物進行PCR擴增，然后將PCR擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶酶切，酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳將DNA片段分開，溴化乙錠(EB)染色，觀察其多態(tài)性。與RFLP技術(shù)一樣，CAPs技術(shù)檢測的多態(tài)性其實是酶切片段大小的差異。Talbert等(1994)在小麥中將RFLP標記轉(zhuǎn)化為STS標記過程中，有些STS標記無多態(tài)，但酶切后又出現(xiàn)多態(tài)性。CAPs作為一種分子標記，有以下幾個優(yōu)點：①引物與限制酶組合非常多，增加了揭示多態(tài)性的機會，而且操作簡便，可用瓊脂糖電泳分析。②在真核生物中，CAPs標記呈共顯性。③所需DNA量少。④結(jié)果穩(wěn)定可靠。⑤操作簡便、快捷、自動化程度高。CAPs標記最成功的應用是構(gòu)建擬南芥遺傳圖譜。Konieczny等(1993)將RFLP探針兩端測序，合成PCR引物，在擬南芥基因組DNA中進行擴增，之后用一系列4堿基識別序列的限制性內(nèi)切酶酶切擴增產(chǎn)物，產(chǎn)生了很多CAPs標記，并且只用了28個巧植株，就將這些CAPs標記定位在各染色體上并構(gòu)建了遺傳圖譜。Itittalmani(1995)等找到了一個抗稻瘟病基因Pi—2(t)的CAPs標記。總之，CAPs標記在二倍體植物研究中可發(fā)揮巨大的作用，是PCR標記的有力補充。但在多倍體植物中的應用有一定局性。另外，CAPs標記需使用內(nèi)切酶，這又增加了研究成本，限制了該技術(shù)的廣泛應用。2．STS(Sequence—tagged sites)STS是序列標簽位點或序標位的簡稱。它是指基因組中長度為200～500bp，且核苷酸／頃序已知的單拷貝序列，可采用PCR技術(shù)將其專一擴增出來。1989年，華盛頓大學的Olson等人利用STS單拷貝序列作為染色體特異的界標(Landmark)，即利用不同STS的排列順序和它們之間的間隔距離構(gòu)成STS圖譜，作為該物種的染色體框架圖(Framework map)，它對基因組研究和新基因的克隆以及遺傳圖譜向物理圖譜的轉(zhuǎn)化研究具有重要意義。STS引物的獲得主要來自RFLP單拷貝的探針序列，微衛(wèi)星序列。其中，最富信息和多態(tài)性的STS標記應該是擴增含有微衛(wèi)星重復順序的DNA區(qū)域所獲得的STS標記。迄今為止，STS引物的設(shè)計主要依據(jù)單拷貝的RFLP探針，根據(jù)已知RFLP探針兩端序列，設(shè)計合適的引物，進行PCR擴增。與RFLP相比，STS標記最大的優(yōu)勢在于不需要保存探針克隆等活體物質(zhì)，只需從有關(guān)數(shù)據(jù)庫中調(diào)出其相關(guān)信息即可。最近，隨著人類基因組研究的深入，表達序列標定(expressed sequence tags，ESTs)應運而生。由于它直接與一個表達基因相關(guān)，很易于轉(zhuǎn)變成STS。STS標記表現(xiàn)共顯性遺傳，很容易在不同組合的遺傳圖譜間進行標記的轉(zhuǎn)移，且是溝通植物遺傳圖譜和物理圖譜的中介，它的實用價值很具吸引力。但是，與SSR標記一樣，STS標記的開發(fā)依賴于序列分析及引物合成，目前仍顯成本太高。目前，國際上已開始收集STS信息，并建立起相應的信息庫，以便于各國同行隨時調(diào)用。第二節(jié) 重要農(nóng)藝性狀基因連鎖標記的篩選技術(shù)MAS育種不僅可以通過與目標基因緊密連鎖的分子標記在早世代對目的性狀進行選擇，同時，也可以利用分子標記對輪回親本的背景進行選擇。目標基因的標記篩選(genetaggmg)是進行MAS育種的基礎(chǔ)。用于MAS育種的分子標記需具備3個條件：①分子標記與目標基因緊密連鎖(最好lcM或更小，或共分離)；②標記適用性強，重復性好，而且能經(jīng)濟簡便地檢測大量個體(當前以PCR為基礎(chǔ))；③不同遺傳背景選擇有效。遺傳背景的MAS則需要有某一親本基因型的分子標記研究基礎(chǔ)。一、遺傳圖譜的構(gòu)建與重要農(nóng)藝性狀基因的標記通過建立分子遺傳圖譜，可同時對許多重要農(nóng)藝性狀基因進行標記。許多農(nóng)作物上已構(gòu)建了以分子標記為基礎(chǔ)的遺傳圖譜。這些圖譜在重要農(nóng)藝性狀基因的標記和定位、基因的圖位克隆、比較作圖以及MAS育種等方面都是非常有意義的。但是由于分子標記數(shù)目的限制，目前作圖親本的選用首先考慮親本間的多態(tài)性水平，育種目標性狀考慮較少，這樣使遺傳圖譜的構(gòu)建與重要農(nóng)藝性狀基因的標記篩選割裂開來。因此，根據(jù)育種目標選用兩個特殊栽培品種作為親本來構(gòu)建作物的品種——品種圖譜，將作物圖譜構(gòu)建和尋找與農(nóng)藝性狀基因緊密連鎖的分子標記有機結(jié)合起來。遺傳作圖的原理與經(jīng)典連鎖測驗一致，即基于染色體的交換與重組。在細胞減數(shù)分裂時，非同源染色體上的基因相互獨立，自由組合，而位于同源染色體上的連鎖基因在減數(shù)分裂前期Ⅰ非姊妹染色單體間的交換而發(fā)生基因重組。用重組率來表示基因間的遺傳距離，圖距單位用厘摩(centi—Morgan，cM)表示，一個cM的大小大致符合1％的重組率。遺傳圖譜只顯示基因間在染色體上的相對位置，并不反映DNA的實際長度。遺傳圖譜構(gòu)建的主要環(huán)節(jié)為：①根據(jù)遺傳材料之間的多態(tài)性確定親本組合，建立作圖群體；②群體中不同植株的標記基因型分析；③借助計算機程序構(gòu)建連鎖群。因此，要構(gòu)建好的遺傳圖譜，首先應選擇合適的親本及分離群體，這直接關(guān)系到建立遺傳圖譜的難易程度，遺傳圖譜的準確性及所建圖譜的適用性。親本間的差異不宜過大，否則會降低后代的結(jié)實率及所建圖譜的準確度。而親本間適度的差異范圍因不同物種而異，通常多態(tài)性高的異交作物可選擇種內(nèi)不同品種作雜交親本，而多態(tài)性低的自交作物則需選擇不同種間或亞種間品種作雜交親本。如玉米的多態(tài)性極好，一般品種間配制的群體就可成為理想的分子標記作圖群體，而番茄的多態(tài)性較差，因而選用不同種間的后代構(gòu)建分子標記作圖群體。用于分子標記的遺傳作圖群體一般分為兩類，一類為暫時性分離群體，包括F2群體、BC等；另一類為加倍單倍體(doubled hap㈤d，DHL)和重組近交系(rebinantlnbredLines，RIL)等永久性分離群體。自花授粉作物與異花授粉作物作圖群體的構(gòu)建方法如圖17—5所示。它們的特點見表17—2。F2群體構(gòu)建比較省時。但由于每個F2單株所提供的DNA有限，且只能使用一代，限制了該群體的作圖能力。BC群體是由F1與親本之一回交產(chǎn)生的群體。由于該群體的配子類型較少，統(tǒng)計及作圖分析較為簡單，但提供的信息量少于F2群體，且可供作圖的材料有限，不能多代使用。若通過遠緣雜交構(gòu)建的F2作圖群體，易發(fā)生向兩極瘋狂分離，標記比例易偏離3：1或1：2：1。第二類為永久性分離群體，包括重組自交系群體、加倍單倍體群體等。RIL群體是由F2經(jīng)多代自交一粒傳(Single seed descendant，簡稱SSD)使后代基因組相對純合的群體。RIL群體一旦建立，就可以代代繁衍保存，有利于不同實驗室的協(xié)同研究，而且作圖的準確度更高。缺點是建立RIL群體相當費時，而且有的物種很難產(chǎn)生RIL群體。DH群體是通過對Fl進行花藥離體培養(yǎng)或通過特殊技術(shù)(如棉花的半配生殖材料)得到單倍體植株后代，再經(jīng)染色體加倍而獲得的純合二倍體分離群體。因此DH群體也能夠長期保存。但構(gòu)建DH群體需深厚的組織培養(yǎng)基礎(chǔ)和染色體加倍技術(shù)。與暫時性群體相比，永久性群體至少有兩方面長處：①群體中各品系的遺傳組成相對固定，可以通過種子繁殖代代相傳，不斷地增加新的遺傳標記，并可在不同的研究小組之間共享信息；②可以對性狀的鑒定進行重復試驗以得到可靠的結(jié)果。這對于某些病害的抗性鑒定以及受多基因控制且易受環(huán)境影響的數(shù)量性狀的分析尤為重要。許多重要的農(nóng)藝性狀，如抗病性、抗蟲性、育性、一些抗逆性(抗鹽、抗旱)等都表現(xiàn)為質(zhì)量性狀遺傳的特點。由于這些性狀只受單基因或少數(shù)幾個主基因控制，一般均有顯隱性，在分離世代無法通過表型來識別目的基因位點是純合還是雜合，在幾對基因作用相同時(如一些抗病基因?qū)Σ【牟煌硇》N反應不同)，無法識別哪些基因在起作用。特別是一些質(zhì)量性狀雖然受少數(shù)主基因控制，但其中許多性狀的表現(xiàn)還受遺傳背景，微效基因以及環(huán)境條件的影響。所以利用分子標記技術(shù)來定位、識別質(zhì)量性狀基因，特別是利用分子標記對一些易受環(huán)境影響的抗性基因的選擇就變得相對簡單。二、近等基因系的培育與重要農(nóng)藝性狀基因的標記近等基因系(NIL)是Young等人最早提出來的。近等基因系的培育主要是通過多次的定向回交，它與原來的輪回親本就構(gòu)成了一對近等基因系(圖6—1)。在回交導人目標性狀基因的同時，與目標基因連鎖的染色體片段將隨之進入回交子代中(圖17—6)。NIL作圖的基本思路是鑒別位于導人的目標基因附近連鎖區(qū)內(nèi)的分子標記，借助于分子標記定位目標基因。利用這樣的品系可在不需要完整遺傳圖譜的情況下，先用一對近等基因系篩選與目標基因連鎖的分子標記，再用近等基因系間的雜交分離群體進行標記與目的基因連鎖的驗證，從而篩選出與目標基因連鎖的分子標記。Param等1991年運用212個隨機引物對萵苣抗感霜霉病(Dm