【文章內(nèi)容簡介】 分為物理因素、化學因素、和生物化學因素。物理因素：達到平衡的方法、溫度、重力、壓力、介質(zhì)的電解質(zhì)性質(zhì)和黏度、均相或非均相成核等?；瘜W因素：PH、沉淀劑類型和濃度、離子種類和強度、過飽和度、氧化/還原環(huán)境、酶濃度、交聯(lián)體、去垢劑和雜質(zhì)的存在等。生物化學因素：酶純度、抑制劑、酶蛋白的聚集狀態(tài)、酶水解、化學和遺傳修飾、蛋白質(zhì)自身的對稱性、穩(wěn)定性和等電點等。第四章 固定化酶與固定化細胞、固定化酶和固定化細胞作為催化劑的優(yōu)缺點。（1）酶作為生物催化劑的優(yōu)缺點優(yōu)點 ：專一性強；催化效率高；催化反應的條件溫和；活性可以調(diào)節(jié)。缺點 ：穩(wěn)定性差；分離純化困難，因此一般成本都比較高；使用后回收困難，不能重復使用，同時也為產(chǎn)物的純化帶來困難。（2）固定化酶的優(yōu)缺點優(yōu)點①極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝。②可以在較長時間內(nèi)反復使用，有利于工藝的連續(xù)化、管道化。③酶反應過程可以嚴格控制，有利于工藝自動化。④在絕大多數(shù)情況下提高了酶的穩(wěn)定性。⑤較能適應于多酶反應。⑥酶的使用效率提高，產(chǎn)物得率提高，產(chǎn)品質(zhì)量有保障，成本低。缺點①酶固定化過程中發(fā)生的物理化學變化會使酶的活性中心受損，可能導致酶活性降低。②酶連接于固相載體后，酶蛋白的構象和活性中心都可能發(fā)生改變，而且載體骨架和側(cè)鏈可能造成空間位阻，從而影響底物與酶分子接近，進而降低酶分子的實際催化活力。③只適用于催化可溶性和較小分子的底物，對大分子底物不適宜。④與完整細胞相比，其不適宜于多酶反應，特別是需要輔助因子的反應。（3）固定化細胞的優(yōu)缺點固定化細胞的優(yōu)勢固定化細胞與固定化酶比較，其優(yōu)越性在于：①固定化細胞保留了胞內(nèi)原有的多酶系統(tǒng)。使得它既可以作為單一的酶發(fā)揮作用，又可利用它所包含的復合酶系完成一部分代謝乃至整個發(fā)酵過程，特別是那些需要輔助因子參與的合成代謝過程，如乙醇發(fā)酵、合成干擾素等。②固定化細胞保持了胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)與天然環(huán)境，因而更穩(wěn)定。由于固定化細胞兼具游離細胞完整的酶系統(tǒng)和酶的固定化技術二者的優(yōu)點，因而它可以省去酶的分離純化工作，大大降低成本，并減少酶的活性損失，這一點對于細胞內(nèi)酶與不穩(wěn)定的酶來說特別有意義，加上固定化細胞的制備與使用都比固定化酶更簡便，所以固定化細胞在工業(yè)生產(chǎn)和科學研究中都得到了廣泛的應用。固定化生長細胞與游離細胞相比，其優(yōu)越性表現(xiàn)為：①固定化生長細胞可以增殖，提高細胞的密度，因此可以獲得高度密集而體積縮小的基因工程菌集會體，不需要經(jīng)歷普通發(fā)酵的多次培養(yǎng)、放大，從而可以縮短發(fā)酵周期，提高生產(chǎn)能力。②可以提高基因工程菌的遺傳穩(wěn)定性，發(fā)酵性能較穩(wěn)定，可以較長時間反復使用或連續(xù)使用，有利于生產(chǎn)自動化。③用固定化細胞發(fā)酵時，發(fā)酵液中基本不含（或含有很少）菌體，有利于產(chǎn)品的分離純化和提高產(chǎn)品質(zhì)量。由于固定化細胞既利用了固定化酶所具有的一些優(yōu)點，如產(chǎn)物易分離、生產(chǎn)易連續(xù)化和自動化，又利用了細胞所具有的完整酶系統(tǒng)和細胞膜的選擇通透性，同時固定化細胞的制備又比固定化酶容易，因此目前認為固定化細胞的應用前景可能會更好一些。 固定化細胞的局限性①這種技術僅能用于產(chǎn)生胞內(nèi)酶的菌體。②細胞內(nèi)多種酶的存在，會形成不需要的副產(chǎn)物。因此有時需要采取加熱、加酸、加堿或表面活性劑等預處理措施。例如，用固定化產(chǎn)氨短桿菌把延胡索酸轉(zhuǎn)化為蘋果酸，為了阻止琥珀酸的同時生成，可先用膽酸鹽進行抽提處理；解決副反應問題的另一辦法則是采用不同菌株。③固定化細胞不僅有固定化帶來的擴散限制，比如載體形成的孔隙大小會影響高分子底物的通透性等，而且還增添了細胞膜、細胞壁的擴散限制作用。④由于微生物本身的復雜性，形成的固定化細胞一般在穩(wěn)定性和酶活力水平上都比較低。⑤使用初期往往會有一些細胞組分滲出，影響產(chǎn)品質(zhì)量。⑥如果底物（或產(chǎn)物）為高分子物質(zhì)或不溶性物質(zhì)，使用時就十分麻煩。、固定化的基本原理以及各自的優(yōu)缺點。（1）載體結(jié)合法就是把酶結(jié)合到一種水不溶的固體載體上，根據(jù)結(jié)合的方式不同又可分為下列幾種方法。物理吸附法無機載體，如高嶺土、硅膠、氧化鋁、活性炭、羥基磷灰石等。有機載體，如纖維素、合成樹脂、骨膠原、淀粉等。吸附容量比無機載體高。離子結(jié)合法離子結(jié)合法是指在適宜的pH和離子強度條件下，酶通過離子鍵結(jié)合到具有離子交換基的水不溶性載體中的固定化方法，因而也稱離子交換吸附法。物理吸附法的優(yōu)點是：利用此法進行固定化，酶的活性中心不易被破壞，且酶的高級結(jié)構變化少，因而酶活力損失很少。但是物理吸附法固定的酶與載體相互作用力弱、酶容易從載體上脫落下來。與物理吸附法相似，離子結(jié)合法的優(yōu)點是：操作簡單，處理條件溫和，酶的高級結(jié)構和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，能得到酶活回收率高的固定化酶。缺點是：載體和酶的結(jié)合力比較弱，容易受緩沖液種類或pH的影響，在離子強度高的條件下進行反應時，酶往往會從載體上脫落。但是與物理吸附劑相比，離子交換劑的吸附容量一般大于物理吸附劑，約50～150 mg蛋白每克載體。共價結(jié)合法共價結(jié)合法是指借助共價鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團和載體的功能基團進行偶聯(lián)的固定化方法。（2）無固體載體交聯(lián)法交聯(lián)法是指利用雙功能或多功能試劑（bifunctionalor multi－functional reagent）在酶分子間、酶分子與惰性蛋白間進行交聯(lián)反應，以共價鍵制備固定化酶的方法。它與共價結(jié)合法的不同之處是它不使用載體。交聯(lián)法的優(yōu)點是操作簡便。其缺陷則是交聯(lián)反應的過程往往比較激烈，因為交聯(lián)反應可能發(fā)生在酶分子間，也可能發(fā)生于分子內(nèi)，分子間交聯(lián)和分子內(nèi)交聯(lián)的比例在一定程度上和酶的濃度與交聯(lián)試劑的濃度有關，也與pH、離子強度有關，如果交聯(lián)條件控制不合適，許多酶易在固定化過程中失效，酶回收率不高。（3）包埋法包埋法是將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合促進劑（包括交聯(lián)劑）的作用進行聚合，酶被包埋在聚合物中以達到固定化。包埋法操作簡單，由于酶分子只被包埋，未受到化學反應，可以制得較高活力的固定化酶．對大多數(shù)酶、粗酶制劑甚至完整的微生物細胞都是適用的。但是，只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過凝膠網(wǎng)絡，而對大分子底物不適宜。凝膠包埋凝膠包埋法是將酶分子包埋在多孔凝膠中。微囊化微囊型包埋是指將一定量的酶溶液包在半透性的高分子微孔膜內(nèi)。與凝膠包埋法相比，微囊法包埋的優(yōu)點是：固定化酶顆粒比前者要小得多，比較有利于底物和產(chǎn)物擴散，能容許小分子底物和產(chǎn)物自由出入膜內(nèi)外，由于囊的表面積與相對體積的比值大，故物質(zhì)交換可以進行得十分迅速。另一方面半透膜還能阻止蛋白質(zhì)分子滲漏和進入，注人體內(nèi)時既可避免引起免疫過敏反應，同時也可免遭蛋白水解酶的降解，因此其具有較大的醫(yī)學價值。缺點是反應條件要求高，制備成本也較高。（4）不同固定化方法的聯(lián)用不同的固定化方法有各自的優(yōu)缺點，在實際的固定化操作中，經(jīng)常把各種固定化方法聯(lián)用，以獲得最佳效果。通常的聯(lián)用有吸附加交聯(lián)和包埋加交聯(lián)。由于選用的固定化方法不同，固定化酶的活力和性質(zhì)也有所不同，因此需要對不同的固定化方法進行評價。評價的指標主要有：（1）固定化酶的比活每克（毫克）干固定化酶所具有的酶活力單位?；颍簡挝幻娣e（cm2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。（2）操作半衰期是衡量穩(wěn)定性的指標。指在連續(xù)使用的條件下，固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時間（t1/2）。固定化酶的操作半衰期是影響其實際應用的重要因素。(3)偶聯(lián)效率＝（加入的蛋白量－溶液中殘留的蛋白量）/加入的總蛋白量100％(4)活力回收＝(固定化酶活力/投入的總酶活力)100％(5)相對酶活力 具有相同酶蛋白量的固定化酶活力與游離酶活力的比值。(6)酶載量 單位載體所固定的酶活力（或酶蛋白量）。（固定化酶的性質(zhì)）。（1）穩(wěn)定性 大多數(shù)酶固定化后，穩(wěn)定性都增強，操作壽命和保存壽命也延長。（2）固定化酶的最適溫度和最適pH 固定化后，大多數(shù)酶的熱穩(wěn)定性提高，所以最適溫度也隨之提高。酶固定化后，對底物作用的最適pH和酶活力－pH曲線常常會發(fā)生偏移。帶負電荷的載體固定化的酶的最適pH向堿性偏移，帶正電荷的載體固定化的酶的最適pH向酸性偏移。（3）固定化酶的動力學特征 固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km隨載體的帶電性能變化。（4）固定化酶的專一性 酶固定化后，一般不會改變其專一性。但也有少數(shù)情況酶固定化后專一性會發(fā)生改變。固定化細胞的優(yōu)勢和局限性（第1題第（3）項）。 第五章 化學酶工程1. 簡述酶分子化學修飾的基本原理酶的化學修飾主要是對一些活潑性比較強的氨基酸側(cè)鏈基團進行修飾。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。這些基團在酶蛋白分子中可以形成各種次級鍵，對酶蛋白空間結(jié)構的形成和穩(wěn)定有重要作用。這些側(cè)鏈基團一旦改變將引起酶蛋白空間構象及微環(huán)境的改變，從而改變酶的特性和功能。對這些基團進行修飾后，對酶的性質(zhì)影響大，修飾效果明顯。？ 首先要強調(diào)的是，我們對酶進行修飾的目的就是要改變酶的結(jié)構和特性，而且要使這種改變朝著對人類有用的方向進行。不管是從理論上分析還是從實際修飾的結(jié)果來看，酶經(jīng)修飾之后，性質(zhì)朝任何方向改變的可能性都存在，而且多數(shù)改變都是不利的。酶修飾之后，性質(zhì)的變化因酶、修飾劑和修飾方法的不同而出現(xiàn)很大的差異。（1）熱穩(wěn)定性 用前面介紹的一些修飾劑對酶進行修飾，在多數(shù)情況下可以提高酶的穩(wěn)定性。但PEG沒有明顯的提高。（2）抗原性 抗原性是藥物用酶必須解決的問題。在前面介紹過的修飾劑中，被認為可以消除酶的抗原性的修飾劑只有PEG和人血清白蛋白。（3）對各類失活因子的抵抗力 由于酶修飾之后，表面會帶上修飾劑而受到保護，因此，酶修飾之后，抵抗蛋白酶水解和其它失活因子的能力普遍增強。（4）在生物體內(nèi)的半衰期 由于修飾之后，穩(wěn)定性和對抗各種失活因子的能力增強，因此，半衰期也普遍延長。3. 酶分子的哪些側(cè)鏈可以被修飾？①羧基可用碳二亞胺、硼氟化三甲烊鹽和甲醇修飾②氨基可用酸酐、鹵代乙酸、芳基鹵和芳香族磺酸等修飾③巰基包括形成二硫鍵、有機汞、取代、氧化等幾種方式。④咪唑基⑤（酚）羥基⑥胍基⑦色氨酸吲哚基4. 為什么環(huán)糊精及其衍生物可以作為模擬酶模型，該模型與大型環(huán)冠醚模擬酶模型有何區(qū)別？