【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 spergillius niger)、鐮刀霉(Fusarium sp.)、擬青霉 (Paecilomyces sp.)和斜臥青霉(Penicillium decumbens)等的纖維素酶。酵母雖然不產(chǎn)纖維素酶，但可以利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)纖維素酶基因，其產(chǎn)物高度糖基化，經(jīng)正確加工修飾后可直接分泌到培養(yǎng)基中，表達(dá)水平高。如用酵母表達(dá)的 CBHⅡ、EGⅠ的產(chǎn)量可達(dá) 100mg/L 以上，并具有正常的生物學(xué)活性。 纖維素酶的應(yīng)用 在食品工業(yè)上的應(yīng)用是纖維素酶應(yīng)用最廣泛的行業(yè)，纖維素酶既可以將纖維素水解成葡萄糖，又可以通過(guò)提高植物細(xì)胞壁的通透性而提高細(xì)胞內(nèi)含物的提取率。用纖維素酶進(jìn)行果蔬處理可以避免香味和維生素的流失，同時(shí)可以提高消化性和口感。采用纖維素酶水解法對(duì)海藻粉進(jìn)行處理可以充分獲得還早中的油脂資源。速溶茶飲在加工生產(chǎn)時(shí)常用熱水浸提法提取茶飲的有效成分，采用沸水浸泡和纖維素酶法結(jié)合既可以縮短提取時(shí)間又可以保證茶飲原有色、香、味。將纖維素酶應(yīng)用于果蔬榨汁可提升提取率。 在釀酒工業(yè)上的應(yīng)用 [29]我國(guó)釀酒所用原料主要是玉米、高粱、淀粉質(zhì)原料，這些原料中含有1%到3%的纖維素，在纖維素酶的作用下可轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖。纖維素酶可以破壞這些原料的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)促成淀粉的釋放，有利于糖化酶的作用。另外纖維素酶的第一章 緒論 研究進(jìn)展，立項(xiàng)依據(jù)6使用使發(fā)酵液、糖化液的粘度降低，有利于酒糟的分離。以大豆為原料釀造醬油過(guò)程中添加纖維素酶可使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和碳水化合物釋放。這樣既可以提高醬油濃度，改善醬油質(zhì)量，又能縮短生產(chǎn)周期，從而提高生產(chǎn)率。 在造紙工業(yè)上的應(yīng)用纖維素酶作為一種特殊的催化劑，在紙漿造紙工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中已經(jīng)有了不少實(shí)際應(yīng)用。如制漿、樹(shù)脂障礙控制、漂白、廢紙脫墨以及廢水處理等。酶法脫墨是一種新型的脫墨工藝，與常規(guī)堿法脫墨相比有明顯優(yōu)勢(shì)，它可以在提高脫墨效率的同時(shí)降低能耗，減輕環(huán)境污染，并且具有游離度高、濾水性能好、物理性能優(yōu)、白度高和殘余油墨量低的優(yōu)點(diǎn)。纖維素酶、木聚糖酶及淀粉酶在混合辦公廢紙、新聞紙脫墨中的協(xié)同作用，可優(yōu)化混合辦公廢紙酶法脫墨的工藝條件。 在紡織工業(yè)上的應(yīng)用 [30]傳統(tǒng)的纖維練漂實(shí)在堿性介質(zhì)中進(jìn)行的，雖然處理結(jié)果可達(dá)到要求，但堿性廢水治理困難。棉織物經(jīng)纖維素酶處理后，去除了表面絨毛，織物變得光潔均勻、富有光澤、手感柔軟，經(jīng)多次洗滌沒(méi)有起球現(xiàn)象。純大麻織物在經(jīng)纖維素酶處理后，不僅手感柔順、豐滿，而且還保持了大麻夏布原有的風(fēng)格。采用纖維素酶處理牛仔類棉織物，不僅能在纖維表面層進(jìn)行可控的“刻蝕” ，使織物產(chǎn)生不均勻的褪色，具有穿著感，而且對(duì)織物內(nèi)部纖維的強(qiáng)力不會(huì)過(guò)度損傷。 里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物 [31]纖維素酶是誘導(dǎo)酶，必須在誘導(dǎo)劑的作用下才能大量表達(dá)。不同的誘導(dǎo)劑對(duì)里氏木霉表達(dá)纖維素酶的誘導(dǎo)效果和使用價(jià)值是不同的，誘導(dǎo)里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的物質(zhì)主要是一些糖類，包括聚糖、寡糖和單糖等。其中以纖維素、槐糖的誘導(dǎo)效果最好,乳糖和纖維二糖的誘導(dǎo)效果次之。 纖維素纖維素是由葡萄糖通過(guò)β1，4糖苷鍵連接而成的葡萄糖線性高聚體，是纖維素酶最天然的誘導(dǎo)劑。纖維素不溶于水，且不能透過(guò)細(xì)胞膜，因此纖維素對(duì)第一章 緒論 研究進(jìn)展，立項(xiàng)依據(jù)7纖維素酶的誘導(dǎo)機(jī)制主要依賴于纖維素酶分解產(chǎn)生的寡糖和單糖,相比于乳糖和纖維二糖,纖維素能夠誘導(dǎo)出較高的纖維素酶。 槐糖槐糖是2個(gè)葡萄糖分子由β1，2糖苷鍵連接所形成，被認(rèn)為是里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的強(qiáng)力的誘導(dǎo)劑?；碧菍?duì)β葡萄糖苷酶的誘導(dǎo)能力較差，且不能誘導(dǎo)其他菌種產(chǎn)生纖維素酶（如青霉和曲霉）。在纖維二糖為誘導(dǎo)劑，甘油為碳源的培養(yǎng)基上，有槐糖的形成，認(rèn)為是β葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷作用，使纖維二糖和葡萄糖轉(zhuǎn)變成了槐糖，因此槐糖被認(rèn)為纖維素酶的直接誘導(dǎo)劑。 乳糖乳糖是一分子葡萄糖和一分子半乳糖經(jīng)過(guò)β1，4半乳糖苷鍵連接形成。乳糖能夠誘導(dǎo)里氏木霉產(chǎn)生β1 ，4半乳糖苷酶和纖維素酶，乳糖不能夠直接進(jìn)入胞內(nèi)，β1 ， 4半乳糖苷酶分解乳糖為半乳糖和葡萄糖，胞外乳糖的分解是里氏木霉生長(zhǎng)和產(chǎn)纖維素酶的限速步驟。乳糖的誘導(dǎo)能力相當(dāng)于纖維素誘導(dǎo)能力的1/3到1/2，但由于其較低的價(jià)格和誘導(dǎo)能力，成為最廣泛應(yīng)用的誘導(dǎo)劑。 纖維二糖纖維二糖是2個(gè)葡萄糖分子由β1，4糖苷鍵連接形成。纖維二糖能夠誘導(dǎo)纖維素酶的形成，但誘導(dǎo)能力較差，曾經(jīng)認(rèn)為纖維二糖是纖維素酶的直接誘導(dǎo)劑，但高濃度的纖維二糖不但沒(méi)有提高纖維素酶的酶活，反而降低了里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的能力，表明高濃度的纖維二糖反而抑制里氏木霉產(chǎn)纖維素酶。在低濃度的纖維二糖流加培養(yǎng)條件下，能夠誘導(dǎo)較高的酶活。 立項(xiàng)依據(jù)纖維素類物質(zhì)是自然界中最具潛力的一種可再生資源，其有效利用是目前人們關(guān)注的熱點(diǎn)。作為降解纖維素的多組分酶系，纖維素酶降解纖維素特異性高，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染小。我國(guó)農(nóng)作物秸稈每年約 6 億噸[32]，如果其中 30%通過(guò)纖維素酶轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖，相當(dāng)于 2 億噸葡萄糖，可大大減少對(duì)糧食產(chǎn)品的需求，有效保障糧食安全。隨著人們對(duì)纖維素酶分子結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理等各方面的深入研究，纖維素酶必將在食品、環(huán)保、能源和資源開(kāi)發(fā)等各領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越大的作用?，F(xiàn)有的纖維素酶生產(chǎn)方法主要采用微生物液體發(fā)酵法，生產(chǎn)菌株以里氏木第一章 緒論 研究進(jìn)展，立項(xiàng)依據(jù)8霉 Trichoderma reesei（T. reesei）及其近緣菌株應(yīng)用最為廣泛 [33]。目前纖維素酶生產(chǎn)的瓶頸問(wèn)題是酶活性低、對(duì)木質(zhì)纖維素分解能力弱、生產(chǎn)周期長(zhǎng)及生產(chǎn)成本高，嚴(yán)重影響了其工業(yè)化應(yīng)用。由于纖維素酶是一類能水解纖維素中 β1,4葡萄糖苷鍵多組分酶系的總稱，其組分復(fù)雜，合成代謝網(wǎng)絡(luò)研究尚不清楚，且在水解纖維素過(guò)程中各酶組分之間存在協(xié)同作用。纖維素酶生產(chǎn)過(guò)程受菌株本身特性、細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境、宏觀環(huán)境以及纖維素類底物特性等多種因素共同影響，是一個(gè)非常復(fù)雜的體系，纖維素酶合成的過(guò)程調(diào)控涉及基因、蛋白質(zhì)及外界環(huán)境等多個(gè)層面。此外，真菌纖維素酶多數(shù)是誘導(dǎo)酶，其合成及表達(dá)須在誘導(dǎo)物存在下才能進(jìn)行，通過(guò)添加誘導(dǎo)物及對(duì)纖維素酶合成途徑進(jìn)行調(diào)控是提高纖維素酶活性的有效方法。由于誘導(dǎo)物種類繁多，誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控機(jī)制呈復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀，目前關(guān)于纖維素酶誘導(dǎo)物和誘導(dǎo)機(jī)理的研究仍沒(méi)得出確定的結(jié)論。況且天然纖維素類物質(zhì)作為生產(chǎn)纖維素酶最具潛力的原料，其成分除纖維素還包括半纖維素和木質(zhì)素等。有文獻(xiàn)報(bào)道半纖維素可誘導(dǎo)木聚糖酶的合成，而木聚糖酶和纖維素酶的合成又有相互促進(jìn)的關(guān)系。本課題組在研究 T. reese S313 以不同纖維素類底物發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的過(guò)程中，也發(fā)現(xiàn)半纖維素含量較高的玉米芯作為底物時(shí)，纖維素酶活高于其他木質(zhì)纖維素底物時(shí)的酶活。但是，玉米芯是如何誘導(dǎo)或影響纖維素酶合成的一問(wèn)題均有待進(jìn)一步深入研究。因此，研究以天然纖維素物質(zhì)為底物的纖維素酶合成過(guò)程機(jī)理，充分挖掘現(xiàn)有生產(chǎn)菌株產(chǎn)纖維素酶的潛力，是解決纖維素酶液體發(fā)酵問(wèn)題的關(guān)鍵。研究真菌纖維素酶誘導(dǎo)機(jī)理，不但為最終揭示纖維素酶表達(dá)調(diào)控及合成機(jī)理提供有力的理論依據(jù)，為纖維素酶高效表達(dá)提供新的思路，還對(duì)纖維素酶高效低成本生產(chǎn)及木質(zhì)纖維素原料的高效利用，解決能源危機(jī)、糧食短缺、環(huán)境污染等問(wèn)題和實(shí)現(xiàn)人類可持續(xù)發(fā)展有重要意義。 本文研究問(wèn)題鑒于國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀,我們提出“高含量的半纖維素是導(dǎo)致玉米芯纖維素酶活提高的原因，其水解產(chǎn)物半乳糖、木聚糖很可能是除纖維二糖和槐糖外的主要誘導(dǎo)物，且?guī)讉€(gè)誘導(dǎo)物之間可能存在協(xié)同作用” 這一假說(shuō)。并以 T. reesei Rut C30 及其突變株 S313（其纖維素酶系組成較平衡且酶活較高）為研究對(duì)象，通過(guò)基因序列比對(duì)，獲得導(dǎo)致突變株高產(chǎn)的關(guān)鍵基因，并對(duì)這些基因進(jìn)行功能分析。采用 HPLC、HPLCMS、NMR、FTIR 等分析手段對(duì)以玉米芯為底物的第一章 緒論 研究進(jìn)展，立項(xiàng)依據(jù)9發(fā)酵液酶組分和代謝物進(jìn)行分析比較，確定其中起誘導(dǎo)作用的關(guān)鍵組分。采用RTPCR 分別分析關(guān)鍵誘導(dǎo)物對(duì)纖維素酶編碼基因 mRNA 的表達(dá)變化。探討玉米芯中各誘導(dǎo)物對(duì)纖維素酶誘導(dǎo)合成的相互作用，構(gòu)建多誘導(dǎo)因子共同作用的玉米芯纖維素酶誘導(dǎo)模型。本研究具有重要的理論和實(shí)際意義，有助于纖維素酶合成機(jī)理的徹底闡述，并為纖維素酶早日實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的理論依據(jù)。 第二章 材料方法10 第二章 材料方法 菌種 里氏木霉 Rut C 30 (Trichoderma reesei Rut C30)保藏于中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所。 主要實(shí)驗(yàn)儀器 儀器名稱 生產(chǎn)廠家SIGMA 318K 型離心機(jī)G154DW 型高壓蒸汽滅菌鍋ZWY2112B 型全溫振蕩器ZDPA2080A 型恒溫培養(yǎng)箱DHG9140A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱SBA40D 生物傳感分析儀Pectramax plus384 酶標(biāo)儀SWCJ1FD 潔凈工作臺(tái)85Z 型恒溫磁力攪拌器PL303 型電子天平S20 型 pH 計(jì)電子計(jì)重天平恒溫水浴鍋移液槍INFORSAG 工業(yè)搖床冰箱電磁爐德國(guó) SIGMA 公司美國(guó) Zealway 儀器有限公司上海至誠(chéng)分析儀器制造有限公司上海至誠(chéng)分析儀器制造有限公司上海一恒科學(xué)儀器有限公司山東省科學(xué)院生物研究所美谷分子儀器（上海）有限公司蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司上海司樂(lè)儀器有限公司瑞士 MettlerToledo 公司瑞士 Seveneasy 公司上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司長(zhǎng)風(fēng)牌芬蘭 Dragon 公司第二章 材料方法11 實(shí)驗(yàn)藥品藥品名稱 生產(chǎn)廠家葡萄糖硫酸銨硫酸鎂吐溫—80酵母膏多聚蛋白胨磷酸氫二鉀無(wú)水氯化鈣氫氧化鈉微晶纖維素檸檬酸3,52 硝基水楊酸酒石酸鉀鈉苯酚焦亞硫酸鈉葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液木聚糖（D+）半乳糖L阿拉伯糖D甘露糖D（ +）纖維二塘硼酸三氯化鐵氯化錳鉬酸銨硫酸銅氯化鋅天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠天津市博迪化工股份有限公司天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠生物生工 上海市松江區(qū)香閔璐 698號(hào)天津市博迪化工股份有限公司天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠天津市科威有限公司天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠成都市科龍化工試劑廠天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司天津市津東天正精細(xì)化工試劑廠天津市科威有限公司山東省科學(xué)院生物研究所天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司天津市元力化工有限公司天津市福晨化學(xué)試劑廠天津市福晨化學(xué)試劑廠天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所第二章 材料方法12天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑 實(shí) 驗(yàn) 試 劑 檸 檬 酸 緩 沖 液Trichoderma reesei 纖維素酶活的測(cè)定采用 ，pH 的檸檬酸緩沖液。Citric acid monohydrate 210gDI water 750mlNaOH add until PH equals (50~60g)Dilute to 1L and check PH . DNS 反 應(yīng) 液蒸 餾 水 1416ml3,5二 硝 基 水 楊 酸 NaOH 混 勻 ， 添 加 ；酒 石 酸 鉀 鈉 306g苯 酚 焦 亞 硫 酸 鈉 微量元素FeSO47H2O ，MnSO4H2O ，ZnSO4 7H2O CoCl2 ，（加蒸餾水 200ml 使之溶解，用 HCl 或 H2SO4 調(diào) ） 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基先 將 馬 鈴 薯 洗 凈 去 皮 ,稱 取 200g 并 切 成 小 塊 ， 加 水 煮 爛 （ 煮 沸 20~30分 鐘 ， 能 被 玻 璃 棒 戳 破 即 可） ，用四層紗布過(guò)濾，再據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需要加葡萄糖和瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至 1000 毫升，分裝試管或者第二章 材料方法13錐形瓶，加塞，包扎， （121℃）滅菌 20 分鐘左右后取出倒入試管擺斜面或者搖勻，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?菌 絲 培 養(yǎng) 基 （ g/L）Glucose 3Polypepton 1Yeast extract Tween80 1(NH4)2SO4