【文章內(nèi)容簡介】 spergillius niger)、鐮刀霉(Fusarium sp.)、擬青霉 (Paecilomyces sp.)和斜臥青霉(Penicillium decumbens)等的纖維素酶。酵母雖然不產(chǎn)纖維素酶，但可以利用酵母表達系統(tǒng)表達纖維素酶基因，其產(chǎn)物高度糖基化，經(jīng)正確加工修飾后可直接分泌到培養(yǎng)基中，表達水平高。如用酵母表達的 CBHⅡ、EGⅠ的產(chǎn)量可達 100mg/L 以上，并具有正常的生物學活性。 纖維素酶的應用 在食品工業(yè)上的應用是纖維素酶應用最廣泛的行業(yè)，纖維素酶既可以將纖維素水解成葡萄糖，又可以通過提高植物細胞壁的通透性而提高細胞內(nèi)含物的提取率。用纖維素酶進行果蔬處理可以避免香味和維生素的流失，同時可以提高消化性和口感。采用纖維素酶水解法對海藻粉進行處理可以充分獲得還早中的油脂資源。速溶茶飲在加工生產(chǎn)時常用熱水浸提法提取茶飲的有效成分，采用沸水浸泡和纖維素酶法結(jié)合既可以縮短提取時間又可以保證茶飲原有色、香、味。將纖維素酶應用于果蔬榨汁可提升提取率。 在釀酒工業(yè)上的應用 [29]我國釀酒所用原料主要是玉米、高粱、淀粉質(zhì)原料，這些原料中含有1%到3%的纖維素，在纖維素酶的作用下可轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖。纖維素酶可以破壞這些原料的細胞壁結(jié)構(gòu)促成淀粉的釋放，有利于糖化酶的作用。另外纖維素酶的第一章 緒論 研究進展，立項依據(jù)6使用使發(fā)酵液、糖化液的粘度降低，有利于酒糟的分離。以大豆為原料釀造醬油過程中添加纖維素酶可使細胞中的蛋白質(zhì)和碳水化合物釋放。這樣既可以提高醬油濃度，改善醬油質(zhì)量，又能縮短生產(chǎn)周期，從而提高生產(chǎn)率。 在造紙工業(yè)上的應用纖維素酶作為一種特殊的催化劑，在紙漿造紙工業(yè)生產(chǎn)過程中已經(jīng)有了不少實際應用。如制漿、樹脂障礙控制、漂白、廢紙脫墨以及廢水處理等。酶法脫墨是一種新型的脫墨工藝，與常規(guī)堿法脫墨相比有明顯優(yōu)勢，它可以在提高脫墨效率的同時降低能耗，減輕環(huán)境污染，并且具有游離度高、濾水性能好、物理性能優(yōu)、白度高和殘余油墨量低的優(yōu)點。纖維素酶、木聚糖酶及淀粉酶在混合辦公廢紙、新聞紙脫墨中的協(xié)同作用，可優(yōu)化混合辦公廢紙酶法脫墨的工藝條件。 在紡織工業(yè)上的應用 [30]傳統(tǒng)的纖維練漂實在堿性介質(zhì)中進行的，雖然處理結(jié)果可達到要求，但堿性廢水治理困難。棉織物經(jīng)纖維素酶處理后，去除了表面絨毛，織物變得光潔均勻、富有光澤、手感柔軟，經(jīng)多次洗滌沒有起球現(xiàn)象。純大麻織物在經(jīng)纖維素酶處理后，不僅手感柔順、豐滿，而且還保持了大麻夏布原有的風格。采用纖維素酶處理牛仔類棉織物，不僅能在纖維表面層進行可控的“刻蝕” ，使織物產(chǎn)生不均勻的褪色，具有穿著感，而且對織物內(nèi)部纖維的強力不會過度損傷。 里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的誘導物 [31]纖維素酶是誘導酶，必須在誘導劑的作用下才能大量表達。不同的誘導劑對里氏木霉表達纖維素酶的誘導效果和使用價值是不同的，誘導里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的物質(zhì)主要是一些糖類，包括聚糖、寡糖和單糖等。其中以纖維素、槐糖的誘導效果最好,乳糖和纖維二糖的誘導效果次之。 纖維素纖維素是由葡萄糖通過β1，4糖苷鍵連接而成的葡萄糖線性高聚體，是纖維素酶最天然的誘導劑。纖維素不溶于水，且不能透過細胞膜，因此纖維素對第一章 緒論 研究進展，立項依據(jù)7纖維素酶的誘導機制主要依賴于纖維素酶分解產(chǎn)生的寡糖和單糖,相比于乳糖和纖維二糖,纖維素能夠誘導出較高的纖維素酶。 槐糖槐糖是2個葡萄糖分子由β1，2糖苷鍵連接所形成，被認為是里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的強力的誘導劑?；碧菍Ζ缕咸烟擒彰傅恼T導能力較差，且不能誘導其他菌種產(chǎn)生纖維素酶（如青霉和曲霉）。在纖維二糖為誘導劑，甘油為碳源的培養(yǎng)基上，有槐糖的形成，認為是β葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷作用，使纖維二糖和葡萄糖轉(zhuǎn)變成了槐糖，因此槐糖被認為纖維素酶的直接誘導劑。 乳糖乳糖是一分子葡萄糖和一分子半乳糖經(jīng)過β1，4半乳糖苷鍵連接形成。乳糖能夠誘導里氏木霉產(chǎn)生β1 ，4半乳糖苷酶和纖維素酶，乳糖不能夠直接進入胞內(nèi)，β1 ， 4半乳糖苷酶分解乳糖為半乳糖和葡萄糖，胞外乳糖的分解是里氏木霉生長和產(chǎn)纖維素酶的限速步驟。乳糖的誘導能力相當于纖維素誘導能力的1/3到1/2，但由于其較低的價格和誘導能力，成為最廣泛應用的誘導劑。 纖維二糖纖維二糖是2個葡萄糖分子由β1，4糖苷鍵連接形成。纖維二糖能夠誘導纖維素酶的形成，但誘導能力較差，曾經(jīng)認為纖維二糖是纖維素酶的直接誘導劑，但高濃度的纖維二糖不但沒有提高纖維素酶的酶活，反而降低了里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的能力，表明高濃度的纖維二糖反而抑制里氏木霉產(chǎn)纖維素酶。在低濃度的纖維二糖流加培養(yǎng)條件下，能夠誘導較高的酶活。 立項依據(jù)纖維素類物質(zhì)是自然界中最具潛力的一種可再生資源，其有效利用是目前人們關(guān)注的熱點。作為降解纖維素的多組分酶系，纖維素酶降解纖維素特異性高，反應條件溫和，環(huán)境污染小。我國農(nóng)作物秸稈每年約 6 億噸[32]，如果其中 30%通過纖維素酶轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖，相當于 2 億噸葡萄糖，可大大減少對糧食產(chǎn)品的需求，有效保障糧食安全。隨著人們對纖維素酶分子結(jié)構(gòu)及作用機理等各方面的深入研究，纖維素酶必將在食品、環(huán)保、能源和資源開發(fā)等各領域發(fā)揮越來越大的作用。現(xiàn)有的纖維素酶生產(chǎn)方法主要采用微生物液體發(fā)酵法，生產(chǎn)菌株以里氏木第一章 緒論 研究進展，立項依據(jù)8霉 Trichoderma reesei（T. reesei）及其近緣菌株應用最為廣泛 [33]。目前纖維素酶生產(chǎn)的瓶頸問題是酶活性低、對木質(zhì)纖維素分解能力弱、生產(chǎn)周期長及生產(chǎn)成本高，嚴重影響了其工業(yè)化應用。由于纖維素酶是一類能水解纖維素中 β1,4葡萄糖苷鍵多組分酶系的總稱，其組分復雜，合成代謝網(wǎng)絡研究尚不清楚，且在水解纖維素過程中各酶組分之間存在協(xié)同作用。纖維素酶生產(chǎn)過程受菌株本身特性、細胞內(nèi)微環(huán)境、宏觀環(huán)境以及纖維素類底物特性等多種因素共同影響，是一個非常復雜的體系，纖維素酶合成的過程調(diào)控涉及基因、蛋白質(zhì)及外界環(huán)境等多個層面。此外，真菌纖維素酶多數(shù)是誘導酶，其合成及表達須在誘導物存在下才能進行，通過添加誘導物及對纖維素酶合成途徑進行調(diào)控是提高纖維素酶活性的有效方法。由于誘導物種類繁多，誘導表達調(diào)控機制呈復雜的網(wǎng)絡狀，目前關(guān)于纖維素酶誘導物和誘導機理的研究仍沒得出確定的結(jié)論。況且天然纖維素類物質(zhì)作為生產(chǎn)纖維素酶最具潛力的原料，其成分除纖維素還包括半纖維素和木質(zhì)素等。有文獻報道半纖維素可誘導木聚糖酶的合成，而木聚糖酶和纖維素酶的合成又有相互促進的關(guān)系。本課題組在研究 T. reese S313 以不同纖維素類底物發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的過程中，也發(fā)現(xiàn)半纖維素含量較高的玉米芯作為底物時，纖維素酶活高于其他木質(zhì)纖維素底物時的酶活。但是，玉米芯是如何誘導或影響纖維素酶合成的一問題均有待進一步深入研究。因此，研究以天然纖維素物質(zhì)為底物的纖維素酶合成過程機理，充分挖掘現(xiàn)有生產(chǎn)菌株產(chǎn)纖維素酶的潛力，是解決纖維素酶液體發(fā)酵問題的關(guān)鍵。研究真菌纖維素酶誘導機理，不但為最終揭示纖維素酶表達調(diào)控及合成機理提供有力的理論依據(jù)，為纖維素酶高效表達提供新的思路，還對纖維素酶高效低成本生產(chǎn)及木質(zhì)纖維素原料的高效利用，解決能源危機、糧食短缺、環(huán)境污染等問題和實現(xiàn)人類可持續(xù)發(fā)展有重要意義。 本文研究問題鑒于國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀,我們提出“高含量的半纖維素是導致玉米芯纖維素酶活提高的原因，其水解產(chǎn)物半乳糖、木聚糖很可能是除纖維二糖和槐糖外的主要誘導物，且?guī)讉€誘導物之間可能存在協(xié)同作用” 這一假說。并以 T. reesei Rut C30 及其突變株 S313（其纖維素酶系組成較平衡且酶活較高）為研究對象，通過基因序列比對，獲得導致突變株高產(chǎn)的關(guān)鍵基因，并對這些基因進行功能分析。采用 HPLC、HPLCMS、NMR、FTIR 等分析手段對以玉米芯為底物的第一章 緒論 研究進展，立項依據(jù)9發(fā)酵液酶組分和代謝物進行分析比較，確定其中起誘導作用的關(guān)鍵組分。采用RTPCR 分別分析關(guān)鍵誘導物對纖維素酶編碼基因 mRNA 的表達變化。探討玉米芯中各誘導物對纖維素酶誘導合成的相互作用，構(gòu)建多誘導因子共同作用的玉米芯纖維素酶誘導模型。本研究具有重要的理論和實際意義，有助于纖維素酶合成機理的徹底闡述，并為纖維素酶早日實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的理論依據(jù)。 第二章 材料方法10 第二章 材料方法 菌種 里氏木霉 Rut C 30 (Trichoderma reesei Rut C30)保藏于中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所。 主要實驗儀器 儀器名稱 生產(chǎn)廠家SIGMA 318K 型離心機G154DW 型高壓蒸汽滅菌鍋ZWY2112B 型全溫振蕩器ZDPA2080A 型恒溫培養(yǎng)箱DHG9140A 型電熱鼓風干燥箱SBA40D 生物傳感分析儀Pectramax plus384 酶標儀SWCJ1FD 潔凈工作臺85Z 型恒溫磁力攪拌器PL303 型電子天平S20 型 pH 計電子計重天平恒溫水浴鍋移液槍INFORSAG 工業(yè)搖床冰箱電磁爐德國 SIGMA 公司美國 Zealway 儀器有限公司上海至誠分析儀器制造有限公司上海至誠分析儀器制造有限公司上海一恒科學儀器有限公司山東省科學院生物研究所美谷分子儀器（上海）有限公司蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司上海司樂儀器有限公司瑞士 MettlerToledo 公司瑞士 Seveneasy 公司上海舜宇恒平科學儀器有限公司長風牌芬蘭 Dragon 公司第二章 材料方法11 實驗藥品藥品名稱 生產(chǎn)廠家葡萄糖硫酸銨硫酸鎂吐溫—80酵母膏多聚蛋白胨磷酸氫二鉀無水氯化鈣氫氧化鈉微晶纖維素檸檬酸3,52 硝基水楊酸酒石酸鉀鈉苯酚焦亞硫酸鈉葡萄糖標準液木聚糖（D+）半乳糖L阿拉伯糖D甘露糖D（ +）纖維二塘硼酸三氯化鐵氯化錳鉬酸銨硫酸銅氯化鋅天津市風船化學試劑科技有限公司天津市北方天醫(yī)化學試劑廠天津市博迪化工股份有限公司天津市北方天醫(yī)化學試劑廠天津市北方天醫(yī)化學試劑廠生物生工 上海市松江區(qū)香閔璐 698號天津市博迪化工股份有限公司天津市北方天醫(yī)化學試劑廠天津市科威有限公司天津市光復精細化工研究所天津市北方天醫(yī)化學試劑廠成都市科龍化工試劑廠天津市風船化學試劑科技有限公司天津市津東天正精細化工試劑廠天津市科威有限公司山東省科學院生物研究所天津市光復精細化工研究所天津市光復精細化工研究所上海藍季科技發(fā)展有限公司上海藍季科技發(fā)展有限公司上海藍季科技發(fā)展有限公司天津市元力化工有限公司天津市福晨化學試劑廠天津市福晨化學試劑廠天津市風船化學試劑科技有限公司天津市光復精細化工研究所第二章 材料方法12天津市北方天醫(yī)化學試劑 實 驗 試 劑 檸 檬 酸 緩 沖 液Trichoderma reesei 纖維素酶活的測定采用 ，pH 的檸檬酸緩沖液。Citric acid monohydrate 210gDI water 750mlNaOH add until PH equals (50~60g)Dilute to 1L and check PH . DNS 反 應 液蒸 餾 水 1416ml3,5二 硝 基 水 楊 酸 NaOH 混 勻 ， 添 加 ；酒 石 酸 鉀 鈉 306g苯 酚 焦 亞 硫 酸 鈉 微量元素FeSO47H2O ，MnSO4H2O ，ZnSO4 7H2O CoCl2 ，（加蒸餾水 200ml 使之溶解，用 HCl 或 H2SO4 調(diào) ） 實驗培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基先 將 馬 鈴 薯 洗 凈 去 皮 ,稱 取 200g 并 切 成 小 塊 ， 加 水 煮 爛 （ 煮 沸 20~30分 鐘 ， 能 被 玻 璃 棒 戳 破 即 可） ，用四層紗布過濾，再據(jù)實際實驗需要加葡萄糖和瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補足水分至 1000 毫升，分裝試管或者第二章 材料方法13錐形瓶，加塞，包扎， （121℃）滅菌 20 分鐘左右后取出倒入試管擺斜面或者搖勻，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?菌 絲 培 養(yǎng) 基 （ g/L）Glucose 3Polypepton 1Yeast extract Tween80 1(NH4)2SO4