【正文】 .......................................................12 PDA 培養(yǎng)基 ..........................................................................................12 菌絲培養(yǎng)基（G/L） ...........................................................................13 誘導(dǎo)培養(yǎng)基（G/L） ...........................................................................13 實(shí)驗(yàn)方法： .....................................................................................................13目錄IV 預(yù)培養(yǎng) ...................................................................................................13 菌絲的獲取 ..........................................................................................13 取樣 .......................................................................................................14 酶活的定義及測(cè)定方法 .......................................................................14第三章 結(jié)果與討論 ................................................................................................18 玉米芯酶解液中糖組分的分析 .....................................................................18 不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)濾紙酶活的情況 ...................................................18 不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn) Β葡萄糖苷酶的情況 ..........................................19 不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)木聚糖酶的情況 ...................................................20 不同組分對(duì)里氏木霉誘導(dǎo)產(chǎn)纖維素酶的影響 .............................................21 不同混合誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)濾紙酶活情況 ...............................................21 不同混合誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn) Β葡萄糖苷酶的情況 ..................................22 半乳糖誘導(dǎo)濃度對(duì)里氏木霉誘導(dǎo)產(chǎn)纖維素酶的影響 .................................23 不同半乳糖濃度對(duì)濾紙酶活的影響 ...................................................23 不同半乳糖濃度對(duì) Β葡萄糖苷酶活的影響 ......................................24結(jié)論 ..............................................................................................................................25參考文獻(xiàn) ......................................................................................................................26致謝 ..............................................................................................................................27附錄…………………………………………………………………………...……...30第一章 緒論 研究進(jìn)展，立項(xiàng)依據(jù)1第一章 緒論 研究進(jìn)展，立項(xiàng)依據(jù) 里氏木霉簡(jiǎn)介里氏木霉（Trichodermareesei ）是多細(xì)胞的真核微生物， 菌 落 呈廣鋪的棉絮狀，起初為白色致密的平坦菌絲，而后邊緣出現(xiàn)淺綠的產(chǎn)孢子叢束區(qū)，反面無(wú)色。其纖維素酶產(chǎn)量高。近年來(lái)的實(shí)踐表明，經(jīng)過(guò)基因工程手術(shù)改造的里氏木霉重組菌株是安全無(wú)害的。纖維素大分子之間排列整齊形成結(jié)晶結(jié)構(gòu)，這種結(jié)晶結(jié)構(gòu)嚴(yán)重影響了它的水解性能。半纖維素比纖維素較容易水解，水解時(shí)可以產(chǎn)生木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖等，其中木糖占一半以上，因此木糖利用對(duì)開(kāi)發(fā)利用半纖維素至關(guān)重要。國(guó)內(nèi)山東大學(xué)曲音波教授課題組已篩選得到一株具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的斜臥青霉 Penicillium decumbens 菌株，并一直致力于該菌株的改造、發(fā)酵工藝及其纖維素酶合成調(diào)控機(jī)理研究 [810]，以期早日得到可工業(yè)化生產(chǎn)的工程菌株。這項(xiàng)突破雖大大降低了纖維素酶成本，但還不能滿足工業(yè)化要求，需進(jìn)一步降低成本以支撐其市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。因此，必須就現(xiàn)有生產(chǎn)菌株，研究其生長(zhǎng)代謝的一般規(guī)律，充分挖掘其生產(chǎn)纖維素酶的潛力，最大限度地提高其纖維素酶的生產(chǎn)能力，從而降低纖維素酶的生產(chǎn)成本。對(duì)于這種理論，如何從分子層面來(lái)解釋纖維素酶的誘導(dǎo)機(jī)理？近年來(lái)，隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的迅速發(fā)展，抗體技術(shù)、RTPCR 技術(shù)、反義 RNA 技術(shù)等的出現(xiàn)以及各種檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，為纖維素酶的各組分及其相關(guān)基因的特異性識(shí)別和定量檢測(cè)提供了合適有效的工具。通過(guò)非離子洗滌劑除去這些蛋白后，破壞了分生孢子啟動(dòng)纖維素降解的作用。此外，三個(gè)正轉(zhuǎn)錄激活子（XYR1 ，ACE2 和 HAP2/3/5 復(fù)合體）與兩個(gè)抑制子（ACE1 和碳代謝物抑制子 CRE1）以及它們對(duì)應(yīng)的基因 xyrace2 、hap2 、haphapace1 和 cre1被報(bào)道參與纖維素酶基因表達(dá)調(diào)控體系 [1924]。另外，CEL5B 酶中含有通過(guò)糖基化磷脂酰肌醇?xì)埢棠さ谋Ｊ匦蛄小?[26]纖維素酶分子大小范圍很廣，內(nèi)切酶分子量介于 23～146KD 之間，外切酶為 38～118KD，β葡萄糖苷酶為 90～100KD（胞內(nèi)）和 47～76KD（胞外酶）。 纖維素酶的作用機(jī)理目前，纖維素的微生物降解機(jī)理被普遍接受的理論主要有三種:協(xié)同理論，碎片理論和原初反應(yīng)假說(shuō) [27]，其中以協(xié)同理論最為廣泛接受。 Wood(1985 年)在研究 Trichoderma reesei 和 Penicillium funiculosumde 的纖維素酶時(shí)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)濾液中的兩種外切酶在液化微晶纖維素和棉纖維時(shí)具有協(xié)同性，即外切—外切協(xié)同性(exoexosynergism) 。該假說(shuō)的基本降解模式如下:C1—結(jié)晶纖維素→Cx —無(wú)定形纖維素→β葡萄糖苷酶—纖維二糖→葡萄糖原初反應(yīng)假說(shuō)認(rèn)為結(jié)晶纖維素的降解是一個(gè)多步驟過(guò)程，并認(rèn)為原初反應(yīng)即無(wú)序反應(yīng)(Amorphogenesis) 使纖維素的結(jié)晶狀態(tài)發(fā)生改變，便于隨后的纖維素水解。目前研究較多的是纖維素粘菌屬、生孢纖維粘菌屬、纖維桿菌和芽孢桿菌屬。真菌產(chǎn)生三類(lèi)纖維素酶，能分泌到菌體外，一般不聚集形成多酶復(fù)合體，但相互發(fā)生強(qiáng)烈的協(xié)同作用。采用纖維素酶水解法對(duì)海藻粉進(jìn)行處理可以充分獲得還早中的油脂資源。 在釀酒工業(yè)上的應(yīng)用 [29]我國(guó)釀酒所用原料主要是玉米、高粱、淀粉質(zhì)原料，這些原料中含有1%到3%的纖維素，在纖維素酶的作用下可轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖。這樣既可以提高醬油濃度，改善醬油質(zhì)量，又能縮短生產(chǎn)周期，從而提高生產(chǎn)率。酶法脫墨是一種新型的脫墨工藝，與常規(guī)堿法脫墨相比有明顯優(yōu)勢(shì)，它可以在提高脫墨效率的同時(shí)降低能耗，減輕環(huán)境污染，并且具有游離度高、濾水性能好、物理性能優(yōu)、白度高和殘余油墨量低的優(yōu)點(diǎn)。棉織物經(jīng)纖維素酶處理后，去除了表面絨毛，織物變得光潔均勻、富有光澤、手感柔軟，經(jīng)多次洗滌沒(méi)有起球現(xiàn)象。 里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)物 [31]纖維素酶是誘導(dǎo)酶，必須在誘導(dǎo)劑的作用下才能大量表達(dá)。 纖維素纖維素是由葡萄糖通過(guò)β1，4糖苷鍵連接而成的葡萄糖線性高聚體，是纖維素酶最天然的誘導(dǎo)劑?；碧菍?duì)β葡萄糖苷酶的誘導(dǎo)能力較差，且不能誘導(dǎo)其他菌種產(chǎn)生纖維素酶（如青霉和曲霉）。乳糖能夠誘導(dǎo)里氏木霉產(chǎn)生β1 ，4半乳糖苷酶和纖維素酶，乳糖不能夠直接進(jìn)入胞內(nèi)，β1 ， 4半乳糖苷酶分解乳糖為半乳糖和葡萄糖，胞外乳糖的分解是里氏木霉生長(zhǎng)和產(chǎn)纖維素酶的限速步驟。纖維二糖能夠誘導(dǎo)纖維素酶的形成，但誘導(dǎo)能力較差，曾經(jīng)認(rèn)為纖維二糖是纖維素酶的直接誘導(dǎo)劑，但高濃度的纖維二糖不但沒(méi)有提高纖維素酶的酶活，反而降低了里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的能力，表明高濃度的纖維二糖反而抑制里氏木霉產(chǎn)纖維素酶。作為降解纖維素的多組分酶系，纖維素酶降解纖維素特異性高，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染小。目前纖維素酶生產(chǎn)的瓶頸問(wèn)題是酶活性低、對(duì)木質(zhì)纖維素分解能力弱、生產(chǎn)周期長(zhǎng)及生產(chǎn)成本高，嚴(yán)重影響了其工業(yè)化應(yīng)用。由于誘導(dǎo)物種類(lèi)繁多，誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控機(jī)制呈復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀，目前關(guān)于纖維素酶誘導(dǎo)物和誘導(dǎo)機(jī)理的研究仍沒(méi)得出確定的結(jié)論。但是，玉米芯是如何誘導(dǎo)或影響纖維素酶合成的一問(wèn)題均有待進(jìn)一步深入研究。 本文研究問(wèn)題鑒于國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀,我們提出“高含量的半纖維素是導(dǎo)致玉米芯纖維素酶活提高的原因，其水解產(chǎn)物半乳糖、木聚糖很可能是除纖維二糖和槐糖外的主要誘導(dǎo)物，且?guī)讉€(gè)誘導(dǎo)物之間可能存在協(xié)同作用” 這一假說(shuō)。探討玉米芯中各誘導(dǎo)物對(duì)纖維素酶誘導(dǎo)合成的相互作用，構(gòu)建多誘導(dǎo)因子共同作用的玉米芯纖維素酶誘導(dǎo)模型。 菌種 里氏木霉 Rut C 30 (Trichoderma reesei Rut C30)保藏于中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所。 實(shí) 驗(yàn) 試 劑 微量元素FeSO4 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基7H2O Trace element solution 25ml/L 預(yù)培養(yǎng)Strain：RutC30孢子懸液接種于裝有 50ml 培養(yǎng)基的 250ml 的搖瓶中，孢子的接種量為108/L 在 28℃，180rpm 條件下?lián)u床培養(yǎng) 24h。 濾紙酶活測(cè)定（total enzyme activity）濾紙酶活測(cè)定包括以下三部分實(shí)驗(yàn)試管的平行和相同處理：發(fā)酵液檢測(cè)，空白和對(duì)照，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)。 （以酶液的稀釋度對(duì)對(duì)應(yīng)生成的葡萄糖作圖，求得釋放 葡萄糖的酶液的稀釋度。5）沸水浴加熱 5 min，終止反應(yīng)。第二章 材料方法159）由標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取樣品的葡萄糖含量。 β葡萄糖苷酶活性分析1．底物： 纖維二糖，溶解于 ，pH 的檸檬酸緩沖液，該反應(yīng)液需要現(xiàn)用現(xiàn)配。3）50℃水浴反應(yīng) 30min。1IU= 1 μmol/min 轉(zhuǎn)化的底物 = 2 μmol/min 生成的葡萄糖的含量在測(cè)定 β葡萄糖苷酶酶活的過(guò)程中，釋放的葡萄糖的絕對(duì)量為 : 葡萄糖= =該反應(yīng)是被 的酶液在 30min 內(nèi)轉(zhuǎn)化的，即 葡萄糖=(30)μmolmin1ml1，纖維二糖的轉(zhuǎn)化 =。 第三章 結(jié)果與討論 不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn) β葡萄糖苷酶的情況第三章 結(jié)果與討論19 圖 32 不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn) β葡萄糖苷酶的情況由圖 32 可以看出，玉米芯對(duì) β葡萄糖苷酶有明顯的誘導(dǎo)作用，而且隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，誘導(dǎo)作用也不斷增長(zhǎng)；微晶纖維素對(duì) β葡萄糖苷酶有較明顯的誘導(dǎo)作用，但是較玉米芯的誘導(dǎo)作用弱,而且隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，誘導(dǎo)作用的增長(zhǎng)逐漸減緩；半乳糖對(duì) β葡萄糖苷酶有較較低水平的誘導(dǎo)作用但是隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增長(zhǎng)，誘導(dǎo)作用的增長(zhǎng)趨勢(shì)不是很明顯；而木聚糖、阿拉伯糖、甘露糖這三種糖對(duì) β葡萄糖苷酶沒(méi)有直接的誘導(dǎo)作用。 不同組分對(duì)里氏木霉誘導(dǎo)產(chǎn)纖維素酶的影響 不同混合誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn) β葡萄糖苷酶的情況第三章 結(jié)果與討論2235 不同混合誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn) β葡萄糖苷酶的情況 由圖 35 以看出玉米芯對(duì)里氏木霉誘導(dǎo)產(chǎn) β葡萄糖苷酶，有很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用；在微晶纖維素中分別添加的混合誘導(dǎo)物中，當(dāng)分別添加為木聚糖和阿拉伯糖、木聚糖和半乳糖、半乳糖和阿拉伯糖時(shí)，雖然 24h 之前誘導(dǎo)作用不是很明顯但是 24h 之后誘導(dǎo)作用有較小幅度的增長(zhǎng)；當(dāng)混合誘導(dǎo)物中分別添加木聚糖和甘露糖、半乳糖和甘露糖時(shí)，在前 24h 內(nèi)，誘導(dǎo)產(chǎn)生 β葡萄糖苷酶的誘導(dǎo)作用也不是很明顯，但是在 24h 之后，誘導(dǎo)作用有較大幅度的提高。 結(jié)論復(fù)合物玉米芯是幾種酶最好的誘導(dǎo)物。參考文獻(xiàn)26n M, Penttil2