【正文】 .......................................................12 PDA 培養(yǎng)基 ..........................................................................................12 菌絲培養(yǎng)基（G/L） ...........................................................................13 誘導培養(yǎng)基（G/L） ...........................................................................13 實驗方法： .....................................................................................................13目錄IV 預(yù)培養(yǎng) ...................................................................................................13 菌絲的獲取 ..........................................................................................13 取樣 .......................................................................................................14 酶活的定義及測定方法 .......................................................................14第三章 結(jié)果與討論 ................................................................................................18 玉米芯酶解液中糖組分的分析 .....................................................................18 不同誘導物誘導產(chǎn)濾紙酶活的情況 ...................................................18 不同誘導物誘導產(chǎn) Β葡萄糖苷酶的情況 ..........................................19 不同誘導物誘導產(chǎn)木聚糖酶的情況 ...................................................20 不同組分對里氏木霉誘導產(chǎn)纖維素酶的影響 .............................................21 不同混合誘導物誘導產(chǎn)濾紙酶活情況 ...............................................21 不同混合誘導物誘導產(chǎn) Β葡萄糖苷酶的情況 ..................................22 半乳糖誘導濃度對里氏木霉誘導產(chǎn)纖維素酶的影響 .................................23 不同半乳糖濃度對濾紙酶活的影響 ...................................................23 不同半乳糖濃度對 Β葡萄糖苷酶活的影響 ......................................24結(jié)論 ..............................................................................................................................25參考文獻 ......................................................................................................................26致謝 ..............................................................................................................................27附錄…………………………………………………………………………...……...30第一章 緒論 研究進展，立項依據(jù)1第一章 緒論 研究進展，立項依據(jù) 里氏木霉簡介里氏木霉（Trichodermareesei ）是多細胞的真核微生物， 菌 落 呈廣鋪的棉絮狀，起初為白色致密的平坦菌絲，而后邊緣出現(xiàn)淺綠的產(chǎn)孢子叢束區(qū)，反面無色。其纖維素酶產(chǎn)量高。近年來的實踐表明，經(jīng)過基因工程手術(shù)改造的里氏木霉重組菌株是安全無害的。纖維素大分子之間排列整齊形成結(jié)晶結(jié)構(gòu)，這種結(jié)晶結(jié)構(gòu)嚴重影響了它的水解性能。半纖維素比纖維素較容易水解，水解時可以產(chǎn)生木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖等，其中木糖占一半以上，因此木糖利用對開發(fā)利用半纖維素至關(guān)重要。國內(nèi)山東大學曲音波教授課題組已篩選得到一株具有自主知識產(chǎn)權(quán)的斜臥青霉 Penicillium decumbens 菌株，并一直致力于該菌株的改造、發(fā)酵工藝及其纖維素酶合成調(diào)控機理研究 [810]，以期早日得到可工業(yè)化生產(chǎn)的工程菌株。這項突破雖大大降低了纖維素酶成本，但還不能滿足工業(yè)化要求，需進一步降低成本以支撐其市場競爭力。因此，必須就現(xiàn)有生產(chǎn)菌株，研究其生長代謝的一般規(guī)律，充分挖掘其生產(chǎn)纖維素酶的潛力，最大限度地提高其纖維素酶的生產(chǎn)能力，從而降低纖維素酶的生產(chǎn)成本。對于這種理論，如何從分子層面來解釋纖維素酶的誘導機理？近年來，隨著基因組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學的迅速發(fā)展，抗體技術(shù)、RTPCR 技術(shù)、反義 RNA 技術(shù)等的出現(xiàn)以及各種檢測技術(shù)的發(fā)展，為纖維素酶的各組分及其相關(guān)基因的特異性識別和定量檢測提供了合適有效的工具。通過非離子洗滌劑除去這些蛋白后，破壞了分生孢子啟動纖維素降解的作用。此外，三個正轉(zhuǎn)錄激活子（XYR1 ，ACE2 和 HAP2/3/5 復(fù)合體）與兩個抑制子（ACE1 和碳代謝物抑制子 CRE1）以及它們對應(yīng)的基因 xyrace2 、hap2 、haphapace1 和 cre1被報道參與纖維素酶基因表達調(diào)控體系 [1924]。另外，CEL5B 酶中含有通過糖基化磷脂酰肌醇殘基固膜的保守序列。 [26]纖維素酶分子大小范圍很廣，內(nèi)切酶分子量介于 23～146KD 之間，外切酶為 38～118KD，β葡萄糖苷酶為 90～100KD（胞內(nèi)）和 47～76KD（胞外酶）。 纖維素酶的作用機理目前，纖維素的微生物降解機理被普遍接受的理論主要有三種:協(xié)同理論，碎片理論和原初反應(yīng)假說 [27]，其中以協(xié)同理論最為廣泛接受。 Wood(1985 年)在研究 Trichoderma reesei 和 Penicillium funiculosumde 的纖維素酶時，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)濾液中的兩種外切酶在液化微晶纖維素和棉纖維時具有協(xié)同性，即外切—外切協(xié)同性(exoexosynergism) 。該假說的基本降解模式如下:C1—結(jié)晶纖維素→Cx —無定形纖維素→β葡萄糖苷酶—纖維二糖→葡萄糖原初反應(yīng)假說認為結(jié)晶纖維素的降解是一個多步驟過程，并認為原初反應(yīng)即無序反應(yīng)(Amorphogenesis) 使纖維素的結(jié)晶狀態(tài)發(fā)生改變，便于隨后的纖維素水解。目前研究較多的是纖維素粘菌屬、生孢纖維粘菌屬、纖維桿菌和芽孢桿菌屬。真菌產(chǎn)生三類纖維素酶，能分泌到菌體外，一般不聚集形成多酶復(fù)合體，但相互發(fā)生強烈的協(xié)同作用。采用纖維素酶水解法對海藻粉進行處理可以充分獲得還早中的油脂資源。 在釀酒工業(yè)上的應(yīng)用 [29]我國釀酒所用原料主要是玉米、高粱、淀粉質(zhì)原料，這些原料中含有1%到3%的纖維素，在纖維素酶的作用下可轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖。這樣既可以提高醬油濃度，改善醬油質(zhì)量，又能縮短生產(chǎn)周期，從而提高生產(chǎn)率。酶法脫墨是一種新型的脫墨工藝，與常規(guī)堿法脫墨相比有明顯優(yōu)勢，它可以在提高脫墨效率的同時降低能耗，減輕環(huán)境污染，并且具有游離度高、濾水性能好、物理性能優(yōu)、白度高和殘余油墨量低的優(yōu)點。棉織物經(jīng)纖維素酶處理后，去除了表面絨毛，織物變得光潔均勻、富有光澤、手感柔軟，經(jīng)多次洗滌沒有起球現(xiàn)象。 里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的誘導物 [31]纖維素酶是誘導酶，必須在誘導劑的作用下才能大量表達。 纖維素纖維素是由葡萄糖通過β1，4糖苷鍵連接而成的葡萄糖線性高聚體，是纖維素酶最天然的誘導劑?；碧菍Ζ缕咸烟擒彰傅恼T導能力較差，且不能誘導其他菌種產(chǎn)生纖維素酶（如青霉和曲霉）。乳糖能夠誘導里氏木霉產(chǎn)生β1 ，4半乳糖苷酶和纖維素酶，乳糖不能夠直接進入胞內(nèi)，β1 ， 4半乳糖苷酶分解乳糖為半乳糖和葡萄糖，胞外乳糖的分解是里氏木霉生長和產(chǎn)纖維素酶的限速步驟。纖維二糖能夠誘導纖維素酶的形成，但誘導能力較差，曾經(jīng)認為纖維二糖是纖維素酶的直接誘導劑，但高濃度的纖維二糖不但沒有提高纖維素酶的酶活，反而降低了里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的能力，表明高濃度的纖維二糖反而抑制里氏木霉產(chǎn)纖維素酶。作為降解纖維素的多組分酶系，纖維素酶降解纖維素特異性高，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染小。目前纖維素酶生產(chǎn)的瓶頸問題是酶活性低、對木質(zhì)纖維素分解能力弱、生產(chǎn)周期長及生產(chǎn)成本高，嚴重影響了其工業(yè)化應(yīng)用。由于誘導物種類繁多，誘導表達調(diào)控機制呈復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)狀，目前關(guān)于纖維素酶誘導物和誘導機理的研究仍沒得出確定的結(jié)論。但是，玉米芯是如何誘導或影響纖維素酶合成的一問題均有待進一步深入研究。 本文研究問題鑒于國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀,我們提出“高含量的半纖維素是導致玉米芯纖維素酶活提高的原因，其水解產(chǎn)物半乳糖、木聚糖很可能是除纖維二糖和槐糖外的主要誘導物，且?guī)讉€誘導物之間可能存在協(xié)同作用” 這一假說。探討玉米芯中各誘導物對纖維素酶誘導合成的相互作用，構(gòu)建多誘導因子共同作用的玉米芯纖維素酶誘導模型。 菌種 里氏木霉 Rut C 30 (Trichoderma reesei Rut C30)保藏于中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所。 實 驗 試 劑 微量元素FeSO4 實驗培養(yǎng)基7H2O Trace element solution 25ml/L 預(yù)培養(yǎng)Strain：RutC30孢子懸液接種于裝有 50ml 培養(yǎng)基的 250ml 的搖瓶中，孢子的接種量為108/L 在 28℃，180rpm 條件下?lián)u床培養(yǎng) 24h。 濾紙酶活測定（total enzyme activity）濾紙酶活測定包括以下三部分實驗試管的平行和相同處理：發(fā)酵液檢測，空白和對照，葡萄糖標準。 （以酶液的稀釋度對對應(yīng)生成的葡萄糖作圖，求得釋放 葡萄糖的酶液的稀釋度。5）沸水浴加熱 5 min，終止反應(yīng)。第二章 材料方法159）由標準曲線讀取樣品的葡萄糖含量。 β葡萄糖苷酶活性分析1．底物： 纖維二糖，溶解于 ，pH 的檸檬酸緩沖液，該反應(yīng)液需要現(xiàn)用現(xiàn)配。3）50℃水浴反應(yīng) 30min。1IU= 1 μmol/min 轉(zhuǎn)化的底物 = 2 μmol/min 生成的葡萄糖的含量在測定 β葡萄糖苷酶酶活的過程中，釋放的葡萄糖的絕對量為 : 葡萄糖= =該反應(yīng)是被 的酶液在 30min 內(nèi)轉(zhuǎn)化的，即 葡萄糖=(30)μmolmin1ml1，纖維二糖的轉(zhuǎn)化 =。 第三章 結(jié)果與討論 不同誘導物誘導產(chǎn) β葡萄糖苷酶的情況第三章 結(jié)果與討論19 圖 32 不同誘導物誘導產(chǎn) β葡萄糖苷酶的情況由圖 32 可以看出，玉米芯對 β葡萄糖苷酶有明顯的誘導作用，而且隨著時間的增長，誘導作用也不斷增長；微晶纖維素對 β葡萄糖苷酶有較明顯的誘導作用，但是較玉米芯的誘導作用弱,而且隨著時間的增長，誘導作用的增長逐漸減緩；半乳糖對 β葡萄糖苷酶有較較低水平的誘導作用但是隨著誘導時間的增長，誘導作用的增長趨勢不是很明顯；而木聚糖、阿拉伯糖、甘露糖這三種糖對 β葡萄糖苷酶沒有直接的誘導作用。 不同組分對里氏木霉誘導產(chǎn)纖維素酶的影響 不同混合誘導物誘導產(chǎn) β葡萄糖苷酶的情況第三章 結(jié)果與討論2235 不同混合誘導物誘導產(chǎn) β葡萄糖苷酶的情況 由圖 35 以看出玉米芯對里氏木霉誘導產(chǎn) β葡萄糖苷酶，有很強的誘導作用；在微晶纖維素中分別添加的混合誘導物中，當分別添加為木聚糖和阿拉伯糖、木聚糖和半乳糖、半乳糖和阿拉伯糖時，雖然 24h 之前誘導作用不是很明顯但是 24h 之后誘導作用有較小幅度的增長；當混合誘導物中分別添加木聚糖和甘露糖、半乳糖和甘露糖時，在前 24h 內(nèi)，誘導產(chǎn)生 β葡萄糖苷酶的誘導作用也不是很明顯，但是在 24h 之后，誘導作用有較大幅度的提高。 結(jié)論復(fù)合物玉米芯是幾種酶最好的誘導物。參考文獻26n M, Penttil2