illumina測序基礎(chǔ)知識(編輯修改稿)
2025-07-16 14:09 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 3種堿基，就特別少。這在反映到照片上去的時侯，就變成：一張照片特別亮，光點很多。而其它的三張照片就特別暗，上面的光點就很少。這時侯，要軟件做空間上的比對，軟件就會覺得困難，因為對于那幾張暗的照片，軟件很難判斷上面的光點，是否與那張亮的照片上的光點真正對得上。結(jié)果，就是判斷出來的可靠性變差。最后，就是測序的數(shù)據(jù)質(zhì)量變差，有效數(shù)據(jù)量也會變少。要解決這個問題，辦法是在測序過程中摻入一些堿基平衡的文庫。例如摻人全基因組文庫?；蛘咭部梢該絀llumina提供的標(biāo)準(zhǔn)的PhiX文庫，這些都是堿基平衡文庫。它的作用，是在每個循環(huán)當(dāng)中，為每一種顏色的照片，都提供足夠多的亮點。這樣，它可以彌補(bǔ)那些不平衡的文庫當(dāng)中缺亮點的問題。BCL文件當(dāng)把4種顏色的光點組成一個文件之后，軟件就會生成一個“.BCL”文件?！?BCL”文件就是光點文件，它對每個光點，記錄了以下的內(nèi)容。首先一個光點處在哪個Lane里面。其次，這個光點在這個Lane的哪個Tile里面。第3，就是這個亮點在這個Tile的X軸和Y軸的座標(biāo)位置。第4，是記錄了這個光點當(dāng)中“紅、黃、藍(lán)、綠”四種光的對應(yīng)的光強(qiáng)。這個圖是BCL文件的一個示意圖。實際上，BCL文件是二進(jìn)制文件，無法拿來直接閱讀。也正是因為BCL文件難于閱讀，并且很難改動，所以，BCL文件幾乎不存在做假的可能。在測序過程當(dāng)中，有許多客戶會要求測序公司提供原始的測序數(shù)據(jù)，如果客戶是包Lane、或者包Flowcell的，一般測序公司是可以提供BCL文件的。客戶在拿到BCL文件之后，可以用“BCL2FASTQ”這個軟件，把BCL文件轉(zhuǎn)化成FASTQ序列語文件。以此，客戶可以來驗證，測序公司提供的數(shù)據(jù)是否是原始的，是否是真實的。再說一下最初生成的那個tiff文件。tiff文件實在太大了，所以，測序儀在測序過程中，只把tiff文件作為中間文件。最后是把這個tiff文件刪掉的。如果客戶想要原始的圖像文件，在HiSeq V4之前，可以讓測序公司保留“.CIF”文件。CIF文件是一種彩色圖案的向量文件，它的優(yōu)點是比tiff文件的數(shù)據(jù)量小很多。測序公司把CIF文件給客戶之后，客戶就可以看到原始的圖像文件了。但是，請注意：在HiSeq升級到V4之后，保留CIF文件的這個選項是被取消掉了。所以，對于要測V4 Lane的客戶來說，是拿不到CIF文件了。堿基識別接下來，我們講一下堿基識別。我們之前講：4種dNTP，各標(biāo)一種熒光基團(tuán)，紅、黃、藍(lán)、綠，四種顏色，根據(jù)顏色來判斷堿基種類。這個實際上是一種簡化了的說法。實際情況，要比這個復(fù)雜得多。來看這個圖，這是2種熒素的熒光的波長圖。我們會發(fā)覺，這兩種熒光色，它發(fā)出來的發(fā)射光，它在波長上是有交疊的。在X的這個位置，主要是綠色熒光素的貢獻(xiàn)，但是藍(lán)色熒光素，也有少許貢獻(xiàn)。而在Y這個波長位置，藍(lán)色熒光素是做了主要貢獻(xiàn)，但是綠色熒光素，也有少量供獻(xiàn)。在實際測序過程中，是4種熒光素發(fā)出的亮，相互有交疊，相互之間的交系，變得更加復(fù)雜。那么，現(xiàn)在我們要做的事情，是把A、C、G、T，4種熒光素的貢獻(xiàn)給拆開。首先，我們就要確定4種熒光素在4個被測波長處的貢獻(xiàn)率。我們可以看一下，這個表，就是4種熒光素，在4個波長分別有不同的貢獻(xiàn)率。這樣就組成一個4X4的貢獻(xiàn)率表格。我們在實際的分析當(dāng)中，等于解一個4元1次、4聯(lián)方程。因為是4個未知數(shù)，又是4個方程，所以肯定是可以解出來的。說解方程，有點復(fù)雜。那么我們來打一個比方。讓大家來理解這個事情。假設(shè)有一家飯店，它有4個熟客：甲、乙、丙、丁。它日常又提供4道菜：豬肉、白菜、黃瓜、花生。大廚知道：甲最愛吃豬肉、乙最愛吃白菜、丙最愛吃黃瓜、丁最愛吃花生，每個人來了飯店之后，主要吃自己最愛吃的，也會吃些別的菜，但別的菜都吃得不是太多。那么這個大廚不到前臺，看不到今天來的客人。如果，這個大廚想要知道今天來的客人是誰，他有什么辦法呢？看今天哪個菜被吃掉得最多。如果今天的菜被吃掉的最多的是豬肉，那他可以大致地判斷，今天是甲來過了；如果他看到今天被吃掉的菜，最多的是白菜，很可能是乙來過了；那么其它的，道理也是一樣的。希望這個例子可以幫大家來理解一下，這4個熒光和4種堿基的判讀的關(guān)系。Phasing 和 Prephasing接下來，我們再講一下，Phasing和Prephasing。在Illumina的測序過程當(dāng)中，一個簇，大概有5千個到1萬個分子。但是在邊合成、邊測序的過程當(dāng)中，每一步酶反應(yīng)，理想情況下，應(yīng)該這5千個分子都延長1個堿基。但實際情況，總有少量分子沒有完成延長反應(yīng)。也就是說，總有少量的分子會掉隊，我們稱這種掉隊的現(xiàn)象叫“phasing”。Phasing主要是由于酶活性不足，所引起的。如圖所示，掉隊的這個分子，它所發(fā)出的熒光信號，和大部隊所發(fā)出的熒光信號是不一樣的。這個循環(huán)的次數(shù)越多，掉隊的分子就越多。所以，測序越到后面，它Phasing的分子數(shù)就越多。最后，信號的可靠性就越差。除了掉隊的分子，還會有一部分分子，會跑得超前，也就是在一個循環(huán)中，它延長了2個堿基。在一個循環(huán)中延長了2個堿基的最主要的原因，是dNTP上標(biāo)記的那個疊氮基團(tuán)(N3)掉了。我們知道，疊氮基團(tuán)是非常容易從有機(jī)化合物上掉落的。當(dāng)疊氮基團(tuán)掉落之后，dNTP的3’端的羥基就暴露出來了。當(dāng)丟失了疊氮基團(tuán)的dNTP加到（合成鏈的）3’端之后，它的聚合反應(yīng)不會終止，而是會繼續(xù)往前走。當(dāng)再加上了一個帶疊氮基團(tuán)的dNTP之后，這個聚合反應(yīng)才停下來。這樣的后果，就是一個循環(huán)，某些分子，會合成了2個堿基。也就是說比大部隊多走了一步。那么這個多走了一步的堿基，它所發(fā)出來的熒光顏色，也是和大部隊不一樣的。在Illumina測序過程當(dāng)中，Phasing和Prephasing是限制測長的最主
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