【文章內(nèi)容簡介】 十世紀(jì)末β葡聚糖酶大規(guī)模應(yīng)用于啤酒工業(yè)。因此， b葡聚糖酶在啤酒行業(yè)也具有很大的市場潛力。近年來，葡聚糖對制糖工業(yè)的負(fù)面影響越來越受到糖業(yè)界的重視。葡聚糖等多糖的存在導(dǎo)致糖份損失，由于其粘度大，增加了過濾的困難和影響結(jié)晶工序的操作。多糖降低了原糖的質(zhì)量，因為糖類的天然性及高度可溶性，很難在加工中去除它們。因此，β葡聚糖酶在制糖業(yè)中也有極其重要的應(yīng)用。據(jù)文獻(xiàn)報導(dǎo)，因葡聚糖形成而消耗蔗糖將導(dǎo)致大約每10 000噸 甘蔗直接損失7噸蔗糖。由于葡聚糖的存在，導(dǎo)致制糖業(yè)提取率降低，最后糖蜜中殘留蔗糖量增多，造成的損失是蔗糖轉(zhuǎn)化成葡聚糖損失的35倍。有的糖廠防治葡聚糖的方法是添加殺菌劑，不但成本增加，且不符合綠色食品的要求。部分糖廠使用葡聚糖酶來處理煎汁中的葡聚糖，減少了糖分損失，取得了較好效果。此外，β葡聚糖酶在植物有害真菌防治、水解酵母細(xì)胞壁、改性增溶方面的應(yīng)用也有不少研究報道。β葡聚糖酶還可用于牙膏中起到明顯的潔齒作用，應(yīng)用于洗滌劑中增強(qiáng)洗滌產(chǎn)品的去污能力，同時在食品、造紙、油井壓裂等許多方面也被廣泛應(yīng)用。本項目所用基因工程菌能夠成功地胞外分泌b葡聚糖酶，生長速度快，生產(chǎn)周期短，酶產(chǎn)量高（1600 IU/mL），生產(chǎn)每公斤b葡聚糖酶（酶活5000 kIU/kg）成本只需3040元，售價在100元/公斤以上，因此具有很好的收益。東方擬無枝酸菌發(fā)酵生產(chǎn)萬古霉素項目負(fù)責(zé)人：盧英華一、項目的背景與必要性萬古霉素是由東方擬無枝酸菌(Amycolatopsis、oriertalis)的發(fā)酵液中分離得到的具有抗革蘭氏陽性菌的一種糖肽類抗生素，同期由美國禮萊公司開發(fā)成產(chǎn)品，并于1958年獲FDA批準(zhǔn)上市。從上世紀(jì)80年代開始，由于β內(nèi)酯酰胺類抗生素的大量使用，耐藥菌相繼出現(xiàn)，尤其是近幾年來隨著臨床上出現(xiàn)的耐甲氧西林金黃色葡萄(MRSA)和耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)的感染病人增多，并發(fā)現(xiàn)了難辨梭菌(CD)是釀成偽膜性腸炎的主要原因。而目前MRSA被認(rèn)為是最頑固的耐藥菌，它幾乎對所有的β內(nèi)酯酰胺類抗生素包括第三代頭飽菌素都具有耐藥性，對大部分四環(huán)類和氨基糖苷類等其它抗生素也能產(chǎn)生高度的交又耐藥性。至1982年，在美國的大醫(yī)院中，由該耐藥菌引起的感染已由2%上升到20%以上。國內(nèi)的研究表明，1998一2000年耐甲氧西林金黃色葡萄球菌敏感的比例高達(dá)30%。人們發(fā)現(xiàn)，對青霉素過敏患者，萬古霉素與一些氨基糖苷類藥物合用具有協(xié)同作用?？诜f古霉素對產(chǎn)毒的難辨梭菌有效，可用來治療由抗生素引起的偽腸炎。這樣，萬古霉素在臨床上常被用作治療由MRSA引起的嚴(yán)重感染病首選藥物和被用作在β內(nèi)酯酰胺類抗生素或其他抗菌藥物治療失敗后可以使用最后手段，同時萬古霉素被國際抗生素專家譽為 “王牌抗生素”。由于萬古霉素獨特的作用機(jī)制，且多肽類抗生素在體內(nèi)易分解，使其不僅在臨床上而且在畜牧業(yè)上也得到了廣泛的應(yīng)用。萬古霉素適用于治療對甲氧西林具有耐藥性之葡萄球菌所引起的嚴(yán)重或致命感染。對青霉素過敏患者及不能使用其他抗生素包括青霉素和頭孢菌素類或治療無效患者，或是對其他抗菌物質(zhì)具有耐藥性，而對萬古霉素敏感的細(xì)菌所引起的感染，萬古霉素均適用。世界每年萬古霉素的需求量總計大概40～50噸，其中25噸左右在美國市場銷售，其次是日本和歐洲主要國家市場。估計世界年銷售額約在5億～6億美元之間。萬古霉素作為窄譜抗生素的二線用藥，國際市場需求量增幅始終保持在3%～4%之間。從近幾年來萬古霉素的銷售數(shù)量及金額的變化圖來看，數(shù)量及金額的波動變化始終保持一致，并且都呈上升趨勢。2003年，萬古霉素的年銷售額約為2億人民幣，%，在抗菌藥醫(yī)院用藥金額的排行中排在第28位；2004年1季度，%，%，在抗菌藥醫(yī)院用藥金額的排行中排在第25位。而去甲萬古霉素在近幾年的銷售數(shù)量及金額都呈下降趨勢，而且起伏較大，數(shù)量的下滑較金額明顯。2003年，去甲萬古霉素的年銷售額約為1億人民幣，%，在抗菌藥醫(yī)院用藥金額的排行中排在第41位；2004年1季度，%，%，在抗菌藥醫(yī)院用藥金額的排行中排在第43位。二、萬古霉素結(jié)構(gòu)萬古霉素(Vanoomycin)和去甲萬古霉素(Norvanycin)均系糖肽類抗生素，在結(jié)構(gòu)上相似，所不同的是去甲萬古霉素在末端氨基上比萬古霉素少一個甲基。圖1 萬古霉素的結(jié)構(gòu)三、項目成熟程度已完成1噸發(fā)酵罐中試生產(chǎn)實驗，技術(shù)指標(biāo)如下：發(fā)酵單位: 60007000 U/mL；發(fā)酵時間： 120 h；提取收率： 5060%。萬古霉素生產(chǎn)流程搖瓶種子液斜面孢子甘油管發(fā)酵液二級培養(yǎng)液一級培養(yǎng)液柱層析柱吸附濾液納濾超濾解析液 凍干粉精制濾液萬古霉素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。四、應(yīng)用范圍、前景和收益人用新型抗生素和畜牧業(yè)新型抗生素，萬古霉素原料藥（藥品級）目前市場價在1500美元/公斤以上，生產(chǎn)成本約為1300人民幣/公斤，利潤非常可觀，且市場銷售量大。褐黃孢鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)新型生物防腐劑納他霉素項目負(fù)責(zé)人：盧英華，敬科舉一、項目的背景與必要性食品在加工和貯藏過程中極易受到微生物的污染，一般用來殺滅或阻止腐敗菌和致病菌生長, 以增加食品安全性和延長其貨架期的方法大致可分為下列三大類: ①物理方法, 采用溫度處理(低溫或高溫) ，降低Aw 值，氣調(diào)、輻照、高壓和脈沖殺菌等。②化學(xué)方法：使用無機(jī)、有機(jī)化學(xué)合成藥物和發(fā)煙。③生物方法, 添加食用級的微生物或其發(fā)酵劑，從而產(chǎn)生抗微生物代謝物(自然發(fā)酵和控制發(fā)酵) 。許多加工處理方法和防腐劑只能殺死部分微生物，即使經(jīng)過超高溫殺菌后仍可能有活菌殘留。而且, 許多殺菌方法還對食品的風(fēng)味和質(zhì)地有不良影響, 更重要的是會破壞其中的營養(yǎng)成分, 降低了食品的營養(yǎng)價值。在傳統(tǒng)食品保藏中加入了化學(xué)防腐劑雖然可顯著的延長食品的保質(zhì)期，但許多防腐劑影響人類健康。因此, 人們逐漸把注意力轉(zhuǎn)向天然防腐劑的開發(fā)和應(yīng)用上來, 利用微生物制取天然生物防腐劑已成為食品保藏研究的熱點，從微生物資源中開發(fā)天然食品防腐劑具有十分廣闊的前景。納他霉素(Natamycin)也稱游鏈霉素(Pimaricin)，是由一種納塔爾鏈霉菌(Streptomyces Natalensis)經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類物質(zhì)，能有效地抑制和殺死霉菌及酵母菌，商品名稱為霉克。美國CFR 編碼：21CFR1721155，其中對納他霉素(Natamycin) mg/kg，即按60 kg 體重計算, mg。納他霉素是國內(nèi)批準(zhǔn)使用的僅有的二種食品生物防腐劑（抗生素）之一。根據(jù)我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB2760) 規(guī)定，食物最大殘留量10 mg/kg。而納他霉素在實際中的使用量為106 數(shù)量級。因此，納他霉素是一種安全、低毒、高效的新型生物防腐劑，已經(jīng)在很多國家得到廣泛使用，包括歐盟，大部分北美和東歐國家，以及一些中東國家。目前全世界有三十多個國家將納他霉素用于乳制品、肉制品、果汁飲料、葡萄酒等的生產(chǎn)和保藏之中。、 在乳酪中的應(yīng)用納他霉素用于乳酪制品防霉的方法有3種：浸泡薄片狀、方塊狀或車輪狀乳酪；噴灑于乳酪制品表面；乳劑覆膜于乳酪制品上面。1975年Nison等人以制霉菌素為標(biāo)準(zhǔn)對納他霉素對于延長乳酪貨架期的作用進(jìn)行了研究，認(rèn)為納他霉素不但有效延長其保存期，而且不影響其風(fēng)味。納他霉素與山梨酸鉀配合使用能夠達(dá)到乳酪防腐的最佳效果。1992年，日本首次對比研究了納他霉素、無水乙酸、山梨酸在乳酪中的防腐效果，結(jié)論認(rèn)為，納他霉毒用量最小、且保持乳酪風(fēng)味效果最好。另外，納他霉素與對羥基甲酸甲酯合用在防治乳酪感染Phmaglomerata菌方面效果很好。由于納他霉素的微溶性，它幾乎不能進(jìn)入干酪內(nèi)部，且在干酪成熟時，納他霉素慢慢降解。批準(zhǔn)納他霉素可用于乳酪防腐的國家有： 中國、加拿大、法國、德國、意大利、西班牙、美國等26國。、 在乳制品中的應(yīng)用酸奶是一種人工培養(yǎng)含多種對人體有益乳酸菌的乳制品，由于酸奶中含有活性乳酸菌，尤其是L嗜酸菌和雙歧桿菌，飲用后有利于人體健康，其原因是這些有益的活菌能夠存活在消化道，并能通過消化道在大腸中建立一個最佳菌群環(huán)境。因此酸奶這一重要特征的體現(xiàn)在于產(chǎn)品達(dá)到消費者手中時，乳酸菌仍然是活的，這就意味著在發(fā)酵作用結(jié)束時，應(yīng)避免熱處理，而這會影響產(chǎn)品的貨架期。用添加納他霉素的方法可以高效、低成本地抑制真菌，延長產(chǎn)品貨架期，保證加工產(chǎn)品的質(zhì)量。通過510mg/kg的添加量，可使產(chǎn)品的貨架期延長4周以上。、 在果蔬汁飲料中的應(yīng)用霉菌和酵母菌是導(dǎo)致果蔬汁變質(zhì)的主要菌類，添加納他霉素可有效地防止因真菌而引起的變質(zhì)。應(yīng)用20mg/kg的納他霉素可防止因酵母菌污染而導(dǎo)致的果汁發(fā)酵。在富含酵母菌的酒類中加入4mg/kg的納他霉素，能在1h內(nèi)清除酒內(nèi)1/2的酵母菌。應(yīng)用30mg/kg的納他霉素可防止果汁發(fā)酵，使果汁在4℃保存6周，而果汁原有風(fēng)味無任何變化。納他霉素可迅速使果汁中酵母菌的數(shù)量降低。實際應(yīng)用時，在一定的溫度條件下。、 在肉類制品中的應(yīng)用可采用浸泡或噴涂肉類食品來達(dá)到防止霉菌生長的目的，每平方厘米含有4ug的納他霉素時，即可達(dá)到安全而有效的抑菌水平。一般將納他霉素配制成150300mg/kg的懸浮液對肉制品的表面浸泡和噴涂。、 在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用2000年，Wyatt等研究了納他霉素在飼料中的應(yīng)用。他們將191株飼料中可能污染的曲霉接入含有納他霉素的梯度平板中，得出各種曲霉的最小致死量（MIC）；且25mg/L的納他霉素在12小時后能殺死念珠鐮刀菌的孢子。元珊等對納他霉素在家禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用進(jìn)行了報導(dǎo)，即在家禽飼料、飲水及環(huán)境中加入有效劑量的納他霉素，能控制和治療由酵母和霉菌引起的家禽疾病，并且納他霉素在家禽體內(nèi)無殘留。此外，納他霉素還可以作為抗真菌藥物用于水果、種子馬鈴薯和水仙球莖，其效果通常令人滿意。、 其它應(yīng)用納他霉素在治療真菌引起的疾病方面也有良好的應(yīng)用。用納他霉素和崔西桿菌抗生素油膏治療真菌性眼角膜潰瘍的病例。另外，還有納他霉素與兩性菌素B以5g/L，以及納他霉素和鹽酸阿托品配合使用治療該病癥的報導(dǎo)。納他霉素還可用于治療皮膚及粘液膜疾病，也可應(yīng)用于陰道及肺曲霉病的治療。另外，國內(nèi)外也有用納他霉素治療馬角質(zhì)層炎癥、犬類真菌性外耳炎的報導(dǎo)。此外，那他霉素在鮮花、水果保鮮，溫室大棚防治霉菌等方面的應(yīng)用也越來越引起關(guān)注。二、國內(nèi)外技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢目前，報道的納他霉素的產(chǎn)生菌有納塔爾鏈霉菌(Streptomyces natalensis)、恰塔努加鏈霉菌(Streptomyces chatanoogensis)和褐黃孢鏈霉菌(Streptomyces gilvosporeus)。工業(yè)發(fā)酵菌株一般選用納塔爾鏈霉菌和褐黃孢鏈霉菌，國外納他霉素的發(fā)酵水平已經(jīng)穩(wěn)定在7 g/L以上，最高可達(dá)10 g/L。國內(nèi)對納他霉素的研究是從2002年才開始， g/L。2000年，Enshasy和Farid等人報道了發(fā)酵過程中接種物類型和培養(yǎng)條件對納塔爾鏈霉菌搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生納他霉素的影響。指出用抱子接種得到的納他霉素產(chǎn)量比用營養(yǎng)細(xì)胞接種的高40%，用于接種的抱子懸液濃度應(yīng)為108 個/mL。對于培養(yǎng)條件，主要研究了溶氧水平對發(fā)酵的影響，指出向培養(yǎng)基中添加水溶性生物聚合物如褐藻酸鈉可以降低溶氧，使納他霉素產(chǎn)量下降。同年，他們報道了培養(yǎng)基中碳源、氮源及其比例對納他霉素產(chǎn)量的影響，研究表明，氮源的類型對菌體生長和納他霉素的產(chǎn)量有較大影響，菌體細(xì)胞生長最好的氮源是酵母抽提物，而納他霉素產(chǎn)生的最佳氮源是牛肉浸出物，所以，將兩種氮源混合使用則使納他霉素的產(chǎn)量增加兩倍， g/L。國內(nèi)關(guān)于納他霉素的報道始于2002年。北京營養(yǎng)源研究所的李穎輝、李東等人探索了各種碳源、氮源及磷酸鹽對發(fā)酵生產(chǎn)納他霉素的影響，研究表明，較好的碳源和氮源分別為4%低聚糖、%酵母粉和4%魚粉，而5 mg/kg的磷酸鹽對納他霉素的生產(chǎn)最有利。經(jīng)過單因素優(yōu)化后， g / kg。同年，天津輕工業(yè)學(xué)院的何艷玲、烏建國等人對補(bǔ)料分批發(fā)酵提高納他霉素產(chǎn)量的工藝進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在5L自動發(fā)酵罐條件下，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖濃度降至2%以下開始補(bǔ)糖，流加量控制在維持發(fā)酵液糖濃度為2%，這樣可使菌體濃度基本不增或略增，使產(chǎn)生菌的代謝趨于大量合成納他霉素。整個發(fā)酵過程中，葡萄糖總流加量控制在2025g/L。天津科技大學(xué)的李東博士（2004） g/L。2005年浙江大學(xué)駱健美等通過發(fā)酵過程中向培養(yǎng)基中添加丙酸鈉的方法， g/L。廣州微生物所梁淑娃等（2007） g/L，這是目前國內(nèi)有報道最高的發(fā)酵單位。三、項目的產(chǎn)業(yè)化前景分析從研究領(lǐng)域來看，國內(nèi)生物食品防腐劑的研究有抗革蘭氏陽性細(xì)菌的Nisin乳酸鏈球菌素的研究，先后有中科院微生物研究所、北京市營養(yǎng)源研究所、天津科技大學(xué)、天津醫(yī)學(xué)院、天津大學(xué)等單位研究，并由中科院微生物研究所還連棟教授首先在浙江象臺制藥廠實現(xiàn)工業(yè)化。有對革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌具抑制作用的聚賴氨酸的研究，國內(nèi)有天津科技大學(xué)、沈陽藥學(xué)院等單位研究。而抑制霉菌、酵母、絲狀真菌的生物食品防腐劑的研究在我國尚處于剛剛起步階段，距國外研究尚有不小的差距，工業(yè)化生產(chǎn)水平也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國外同行。納他霉素主要用于食品的保鮮，防止霉菌、酵母菌引起的腐敗。國際上FDA和歐盟已經(jīng)批準(zhǔn)用于奶酪和肉制品領(lǐng)域，國際食品市場2007年那他霉素用量超過100噸；我國已批準(zhǔn)將納他霉素用于果汁、月餅、果醬、果凍、腌泡制品、易發(fā)霉食品、加工器皿表面，國內(nèi)食品企業(yè)已逐漸開始接納生物食品防腐劑納他霉素的使用。從應(yīng)用領(lǐng)域來看，據(jù)報道每年有20%以上的糧食及食品因腐敗變質(zhì)而造成巨大的浪費和經(jīng)濟(jì)損失。每年我國糧食霉變損失約占全國總產(chǎn)量的712%。2006年行業(yè)內(nèi)部數(shù)據(jù)統(tǒng)計，為同期火災(zāi)損失的23倍。變質(zhì)食品還會危及人們的身體健康。因食品變質(zhì)導(dǎo)致食物中毒的事件時有發(fā)生，所以，食品的防腐、保鮮、是食品加工、流通、貯存過程中的重要措施之一。在這種嚴(yán)峻形勢下，防腐劑工業(yè)開始蓬勃發(fā)展起來。我國食品防腐劑2006年的總產(chǎn)量就已達(dá)2萬多噸，成為食品工業(yè)的一個重要產(chǎn)業(yè)部門。目前世界各國允許使用的食品防腐劑品種己超過50種，年總消耗量達(dá)8萬噸以上。我