【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 能產(chǎn)生晶體是它區(qū)別于其他芽孢桿菌的標(biāo)志。Bt 傳統(tǒng)分類(lèi)與其他芽孢桿菌一樣也是根據(jù)細(xì)胞學(xué)、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)以及遺傳學(xué)特性。血清學(xué)分類(lèi)是該菌長(zhǎng)期應(yīng)用的一個(gè)最實(shí)用的指標(biāo) ,目前有 70 個(gè)血清型和 84 個(gè)亞種 ,所有血清亞種均可從法國(guó)巴黎的巴斯德研究所索取獲得但其存在的缺點(diǎn)是無(wú)法反映致病性和寄主范圍 ,因而還是有一定的局限性。20 世紀(jì) 90 年代后 , PC 等分子生物學(xué)的方法和技術(shù)廣泛用于該菌的基因鑒定 。Bc 類(lèi)生物除自身外 ,還包括昆蟲(chóng)病原菌 Bt,人類(lèi)病原菌炭疽芽孢桿菌 Bacillus anthracis, Ba 以(及假根狀的覃狀芽孢桿菌 Bacillus mycoides,)Bm。近來(lái)，B. pseudomycoides 和 B. weihens2tephanensis 也收入其中。表型特征和有機(jī)年產(chǎn) 1000 噸蘇云金芽孢桿菌的發(fā)酵車(chē)間工藝設(shè)計(jì)2物利用都無(wú)法區(qū)別 Bt 和 Bc,如細(xì)胞脂肪酸含量、糖含量、多位點(diǎn)酶電泳、腸毒素、噬菌體定型技術(shù)。DNA 同源分析如核糖體、16SrDNA 序列、16S223S 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列、基于 Bc 毒素產(chǎn)物的 PCR 和脈沖膠都無(wú)法區(qū)別 Bt 和 Bc。1992 年 Brousseau 等用隨機(jī)擴(kuò)增指紋技術(shù)區(qū)別 Bt 和 Bc, 1997 年 Giffel 等只發(fā)現(xiàn)少量 Bt 和 Bc 的 16SrDNA 序列有差異 ,1998 年 Beat2tie 等采用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)區(qū)分 Bc 種類(lèi) ,總之 ,Bt和 Bc 是很難區(qū)分的 。隨著 2022 年 4 月美國(guó) Bt 全序列的公布 ,通過(guò)染色體結(jié)構(gòu)比較基因組學(xué)和功能基因組學(xué)的研究 ,一定能更清楚地了解 Bt 和 Bc 的功能和區(qū)別。 孫云錦芽孢桿菌生態(tài)學(xué)及安全性Bt 在自然界中的作用和循環(huán)至今不是很清楚。有些假設(shè)認(rèn)為它是植物共生或互利以保護(hù)植物不受食草動(dòng)物的危害。有些植物化學(xué)物質(zhì)能鈍化 Bt,Luthy 證明棉花葉片的提取液會(huì)使 ICP 失效。在 20℃情況下 ,Btk 可在鮮水中存活 70 d,在海水中存活 40 d。它在湖水中存活時(shí)間比自來(lái)水長(zhǎng)得多 ,因?yàn)榍罢吒缓瑺I(yíng)養(yǎng)。國(guó)內(nèi)外大量試驗(yàn)表明 ,一般應(yīng)用 Bt 還是安全的。但是有點(diǎn)必須給予關(guān)注。一是有些菌株含 β 有 外毒素 ,它對(duì)哺乳動(dòng)物等有毒 ,歐美國(guó)家禁 β 止使用。有些國(guó)家采用含 外毒素的 Bt 產(chǎn)品防治家蠅 ,但許多機(jī)構(gòu)則禁止使用。第二個(gè)問(wèn)題也是爭(zhēng)論比較多的是 Bt 如何與 Bc 分清楚。因?yàn)楹笳邥?huì)導(dǎo)致人的嘔吐和腹瀉。二者都含有腸毒素基因 ,只不過(guò)根據(jù)研究 ,Bt 的基因表達(dá)量很低而已。丹麥?zhǔn)袌?chǎng)的 50%生物農(nóng)藥是 Bt 產(chǎn)品。2022 年 ,丹麥學(xué)者 Rosenquist 等從零售商場(chǎng) 48 901 份樣本中發(fā)現(xiàn)有 0. 5%的樣本含有 Bc 類(lèi)細(xì)菌,總量達(dá) 10 cfu/以上。含淀粉及熟食類(lèi)樣品最多 ,新鮮黃瓜和番茄亦有發(fā)現(xiàn)。隨機(jī)選擇 40 個(gè)菌株 ,發(fā)現(xiàn)至少包括一種致腹瀉的基因或成分 ,而只在 1株 Bc 中發(fā)現(xiàn)催吐毒素。而在隨機(jī)選擇的 40 個(gè) Bc 類(lèi)菌株中 ,有 31 株是 Bt。因此 ,食品中大量的 Bc 類(lèi)細(xì)菌可能應(yīng)屬 Bt 。國(guó)際化學(xué)聯(lián)合會(huì) IUPAC 頒布了 Bt 發(fā)酵產(chǎn)品的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn) Quinlan, 1990 。它包括了產(chǎn)品中其他微生物及其代謝產(chǎn)物的污染。各種微生物及其最大濃度的量是:嗜溫性微生物 1 10 CFU/g ,酵母 和 霉 菌 100 CFU/g , 大 腸 桿 菌 類(lèi) 510 CFU/g ,金黃色葡萄球菌 1 CFU/g ,沙門(mén)氏菌 1 CFU/10g ,蘭斯斐爾德氏鏈球菌 D 組1 10 CFU/g 。 蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)品化國(guó)內(nèi)外至少有 100 多種 Bt 產(chǎn)品 ,在世界范圍內(nèi)防治農(nóng)業(yè)、林業(yè)和衛(wèi)生等害蟲(chóng)廣泛應(yīng)用 ,Bt 制劑占微生物農(nóng)藥的 90%以上。Bt 生產(chǎn)主要是液體深層發(fā)酵。生產(chǎn)工藝主要牽涉到菌種，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 ,后處理工藝、防止噬菌體污染等幾方面。許多科學(xué)家嘗試進(jìn)行菌種選育和改良 ,經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi)外 10 多年的努力 ,盡管我們利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了大量的工程菌 ,但除國(guó)外的 Ciba2Geigy 等少數(shù)公司外 ,工程菌還沒(méi)有大規(guī)模的應(yīng)用于生產(chǎn)。噬菌體污染長(zhǎng)期是 Bt 生產(chǎn)的一大威脅 ,我國(guó)科學(xué)家和企業(yè)緊密配合 ,如湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)院、福建浦城綠安公司等先進(jìn)的 Bt 企業(yè)在實(shí)踐中摸索了一系列控制技術(shù) ,有效地控制了因噬菌體而引起的“倒罐 ”。采用先進(jìn)的后處理工藝是大幅度提高 Bt 產(chǎn)品年產(chǎn) 1000 噸蘇云金芽孢桿菌的發(fā)酵車(chē)間工藝設(shè)計(jì)3效價(jià)的根本性措施。我國(guó) 20 世紀(jì) 50—80 年代所采用的“板框壓濾 ”技術(shù) ,只能生產(chǎn)出低效價(jià)的產(chǎn)品 ,后來(lái)采用“連續(xù)離心 ”,改變了工藝 ,提高了效價(jià) ,當(dāng)今借鑒醫(yī)藥生產(chǎn)所使用的“超濾濃縮”和噴霧干燥 ,使得 Bt 產(chǎn)品得到突飛猛進(jìn)的效果。有關(guān)劑型 ,國(guó)外比國(guó)內(nèi)要豐富得多 ,包括可濕性粉濟(jì)、懸浮劑、水分散顆粒劑、油懸劑、膠囊劑和顆粒劑 ,而國(guó)內(nèi)主要是懸浮劑和可濕性粉劑。我國(guó)由于長(zhǎng)期依賴(lài)于低成本的勞動(dòng)力 ,再加上我們習(xí)慣于消費(fèi)低質(zhì)量低價(jià)格的農(nóng)產(chǎn)品如蔬菜等 ,造成了只注重?cái)?shù)量不注重質(zhì)量的習(xí)慣 ,隨著人們生活水平的不斷提高和對(duì)食品安全的關(guān)注 ,相信一定會(huì)在生物農(nóng)藥工業(yè)做更大的投入 ,將生產(chǎn)出更多高質(zhì)量的 Bt 產(chǎn)品。 設(shè)計(jì)方案 產(chǎn)品方案產(chǎn)量的確定產(chǎn)量的大小直接影響到設(shè)備的配套、車(chē)間的布置和面積、公用設(shè)施和輔助設(shè)施的大小，以及勞動(dòng)力的定員等。班產(chǎn)量主要由原料供用量的多少、生產(chǎn)季節(jié)的長(zhǎng)短、延長(zhǎng)生產(chǎn)期的條件（如冷庫(kù)及半成品加工措施等） 、定型作業(yè)線或主要設(shè)備的生產(chǎn)能力、每天生產(chǎn)班次及產(chǎn)品品種的搭配以及廠房、公用設(shè)施的綜合能力等因素制約。另外，班產(chǎn)量的確定還與市場(chǎng)銷(xiāo)售能力有關(guān)系。生產(chǎn)班制蘇云菌芽孢桿菌生產(chǎn)企業(yè)每天生產(chǎn)班次為 1～2 班。根據(jù)加工品的市場(chǎng)需求，酸乳廠生產(chǎn)工藝特點(diǎn)，原料特性及加工設(shè)備的生產(chǎn)能力和運(yùn)轉(zhuǎn)狀況，一般淡季一班，中季二班，旺季三班。生產(chǎn)天數(shù)及日產(chǎn)量酸乳廠由于受到市場(chǎng)需要、季節(jié)氣候、生產(chǎn)條件（溫度、濕度等）和原料供應(yīng)等方面影響，生產(chǎn)天數(shù)和生產(chǎn)周期大不相同。酸乳生產(chǎn)旺季在夏季 6 月、7 月、8 月，旺季工作日（ ）為 82d。 2 月、3 月、4 月為生產(chǎn)的淡季，工作日為 78d（ ） ，中季生t旺 t淡產(chǎn)為 140d（ ） ，余下 77d 為節(jié)假日和設(shè)備檢修日，則全年生產(chǎn)天數(shù)為：中(d)t?t?旺 淡中 8214073??計(jì)算班產(chǎn)量：2+6+40=48(h)= 天 tn = x300=150(班）總 每 天年產(chǎn) 1000 噸蘇云金芽孢桿菌的發(fā)酵車(chē)間工藝設(shè)計(jì)4q= = =9（t/班）______一周期生產(chǎn)時(shí)間 ______設(shè)備準(zhǔn)備時(shí)間總t 準(zhǔn) 備t______清洗設(shè)備時(shí)間 ______生產(chǎn) Bt 的周期清 洗 生 產(chǎn) ______每天的班次 Q______ 一年要求達(dá)到的產(chǎn)量每 天n q______每班達(dá)到的產(chǎn)量 k——設(shè)備不均系數(shù),在此取 選址本設(shè)計(jì)是在通過(guò)充分的市場(chǎng)調(diào)研，根據(jù)田園集團(tuán)的經(jīng)驗(yàn)， ，在選址方面貫徹了農(nóng)藥工廠選址“應(yīng)遠(yuǎn)離重工業(yè)區(qū)，空氣清新，水質(zhì)清純，環(huán)境幽雅無(wú)污染”的原則，其廠址選擇在遼寧鞍山達(dá)道灣工業(yè)區(qū) 車(chē)間生產(chǎn)過(guò)程設(shè)計(jì)根據(jù)蘇云金芽孢桿菌生產(chǎn)工藝要求，需以下建筑物或構(gòu)筑物。(l)主生產(chǎn)車(chē)間:蘇云金芽孢桿菌生產(chǎn)線。(2)原、輔材料庫(kù):存放生產(chǎn)用的輔料及包裝材料。(3)發(fā)酵室:菌種發(fā)酵用。(4)水處理間:提供液態(tài)生產(chǎn)配料用的凈化水。(5)冷庫(kù):存放蘇云菌芽孢桿菌成品用。(6)空壓機(jī)房:提供某些設(shè)備自動(dòng)化控制所需的壓縮空氣及生產(chǎn)過(guò)程中的需求。(7)化驗(yàn)室:原輔材料的檢驗(yàn)及車(chē)間成品的理化指標(biāo)和微生物的檢測(cè)。(8)更衣室、衛(wèi)生間:供車(chē)間工人使用。(9)鍋爐房:提供生產(chǎn)所需要的蒸汽。(10)配電室:提供生產(chǎn)用電。年產(chǎn) 1000 噸蘇云金芽孢桿菌的發(fā)酵車(chē)間工藝設(shè)計(jì)5第 2 章 工藝流程確定與論證 工藝流程確定 蘇云金芽孢桿菌液體深層發(fā)酵1956 年前蘇聯(lián)發(fā)表了用液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng) Bt，并用于防治菜青蟲(chóng)的報(bào)，從而揭開(kāi)了 Bt 液體培養(yǎng)的序幕，Bt 制劑之所以能廣泛應(yīng)用，關(guān)鍵在于能通過(guò)液體深層發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)。其工藝流程如圖 1 所示。液體發(fā)酵主要有分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵三種方式。分批發(fā)酵一次性投料，工藝簡(jiǎn)單，但若要達(dá)到較高的發(fā)酵水平，需要較高的基質(zhì)濃度，這種情況下很容易產(chǎn)生基質(zhì)和代謝產(chǎn)物抑制，同時(shí)培養(yǎng)基的粘度增加后，由于影響混合和流動(dòng)而不利于氧的傳遞，最終可能使毒效大打折扣。為此人們從反應(yīng)器和工藝角度進(jìn)行了改進(jìn)。采用外環(huán)流氣升式反應(yīng)器，通過(guò)氣體噴射推動(dòng)液體循環(huán)流動(dòng)以取代傳統(tǒng)的機(jī)械攪拌方式，由于能耗低、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、傳質(zhì)效果好、換熱面積大、剪切力低等優(yōu)點(diǎn)，對(duì) Bt 毒效的提高有很大幫助，但目前還缺乏大型生產(chǎn)的經(jīng)驗(yàn)，尚處于研究階段；提高攪拌速度或增大通風(fēng)量以改善供氧環(huán)境，有助于毒效的提高，但勢(shì)必以增加能耗為代價(jià)。于是有人提出了流加工藝，逐漸提高基質(zhì)濃度以削弱抑制，也因此實(shí)現(xiàn)了 Bt 的連續(xù)發(fā)酵，年產(chǎn) 1000 噸蘇云金芽孢桿菌的發(fā)酵車(chē)間工藝設(shè)計(jì)6但長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基很容易染菌，菌種也易發(fā)生退化或產(chǎn)生無(wú)孢突變株。綜合兩者的優(yōu)點(diǎn)，補(bǔ)料分批發(fā)酵被認(rèn)為有較好的發(fā)展前景，即逐漸補(bǔ)料，一次出料。補(bǔ)料方式又可分為連續(xù)式和間歇式，Kang 等研究發(fā)現(xiàn)間歇式補(bǔ)料比連續(xù)式細(xì)菌增殖快，芽孢密度大；連續(xù)式補(bǔ)料在補(bǔ)料過(guò)程中即使細(xì)胞增殖緩慢也不會(huì)像分批發(fā)酵那樣很快轉(zhuǎn)入芽孢期，補(bǔ)料濃度過(guò)高則不能形成芽孢。Zhou 等通過(guò)控制 pH 值來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)料，補(bǔ)料過(guò)程中 pH 保持在 左右，避免了營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩問(wèn)題，蘇云金素產(chǎn)量比分批發(fā)酵提高了 %。 蘇云金芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵起源于我國(guó)傳統(tǒng)的“制曲”技術(shù)，是利用顆粒載體表面所吸附的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或顆粒本身提供的營(yíng)養(yǎng)來(lái)培養(yǎng)微生物。在相對(duì)小的空間內(nèi)，這些顆粒載體可提供相當(dāng)大的氣液界面，從而滿足好氣微生物增殖所需要的水份、氧氣和營(yíng)養(yǎng)。20 世紀(jì) 50年代，國(guó)外開(kāi)始將這項(xiàng)技術(shù)用于 Bt 的發(fā)酵生產(chǎn)。70 年代，我國(guó)許多地區(qū)與單位都進(jìn)行了 Bt 的固態(tài)發(fā)酵研究，直到上世紀(jì) 80 年代，其生產(chǎn)工藝才逐漸完善。傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵按設(shè)計(jì)規(guī)?？煞譃榫W(wǎng)盤(pán)薄層法、皿箱式、大池通風(fēng)法以及地坪式等發(fā)酵方式，如圖 2 所示?？捎糜谔K云金固態(tài)發(fā)酵的原料很廣泛，但選擇時(shí)既要考慮物料的營(yíng)養(yǎng)性，也要考慮載體的通氣性。通常使用的載體可分為有機(jī)載體和無(wú)機(jī)載體兩類(lèi)，有機(jī)載體如麥麩、米糠、黃豆餅粉、花生餅粉等，既可作為營(yíng)養(yǎng)源，又兼有載體作用；無(wú)機(jī)載體如多孔珍珠巖、細(xì)沙等，這些物質(zhì)通氣性能較好，但需要另外添加營(yíng)養(yǎng)成分。楊淑蘭等利用麩皮、棉籽餅粉、米糠、草木灰等為發(fā)酵原料，進(jìn)行年產(chǎn) 1000 噸蘇云金芽孢桿菌的發(fā)酵車(chē)間工藝設(shè)計(jì)7了百公斤級(jí)的 Bt subsp. HD1 固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)種齡、發(fā)酵溫度、初始 pH值、基質(zhì)含水量與草木灰含量等是影響芽孢形成和毒效的重要因素，選擇最佳培養(yǎng)條件可使發(fā)酵芽孢數(shù)穩(wěn)定在 10 10CFUg1，在 2022 倍稀釋度條件下對(duì)菜青蟲(chóng)的致死率為 100%。基質(zhì)的通氣性主要用含水量來(lái)控制。適宜的初始含水量，使得培養(yǎng)基有合適的疏松度，顆粒間存在一定空隙，有助于菌體從培養(yǎng)基獲得營(yíng)養(yǎng)成分和氧的傳遞，從而促進(jìn)生長(zhǎng)繁殖，而過(guò)高的含水量會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基粘結(jié)成團(tuán)，多孔性降低，影響氧的傳遞；含水量過(guò)低，則使培養(yǎng)基膨脹程度降低，水的活度低，抑制菌體生長(zhǎng)。Capalbo 等人將潮濕的稻谷裝入聚丙烯袋接種 Bt subsp. tolworthi 進(jìn)行了固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室研究，濕度控制在 50%~60%，產(chǎn)物田間毒效良好，48 h 死亡率可達(dá) 100%。固態(tài)發(fā)酵具有低投資、低成本、低排污等優(yōu)點(diǎn)，但因輸送、攪拌、溫度、濕度、pH 值和供氧等諸多問(wèn)題缺少工程解決手段而使其發(fā)展受到了限制。陳洪章等人首先提出了壓力脈動(dòng)固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，利用壓力脈動(dòng)周期刺激強(qiáng)化生物反應(yīng)和細(xì)胞膜傳質(zhì)速率。壓力脈動(dòng)避免了機(jī)械攪拌的缺陷，提高了傳質(zhì)傳熱效率，降低溫度、O2 和CO2 濃度梯度，促進(jìn)了毒效的提高。目前，壓力脈動(dòng)固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器已成功放大到 70 m3 的工業(yè)級(jí)生產(chǎn)規(guī)模。 小結(jié)在發(fā)酵過(guò)程中，液態(tài)發(fā)酵流動(dòng)性好，傳質(zhì)、傳熱性能優(yōu)于固態(tài)發(fā)酵，也便于控制；但在后處理過(guò)程中，液態(tài)發(fā)酵通常需要碳酸鈣助濾或離心濃縮，操作復(fù)雜且有效成分易流失，而固態(tài)發(fā)酵可以直接進(jìn)行干燥、粉碎，能源消耗小，但可濕潤(rùn)性較差。綜上所訴，結(jié)合近年來(lái)工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，我采用液體深層發(fā)酵。年產(chǎn) 1000 噸蘇云金芽孢桿菌的發(fā)酵車(chē)間工藝設(shè)計(jì)8第 3 章 物料衡算 生產(chǎn)條件已知發(fā)酵培養(yǎng)接種量為 1%，發(fā)酵時(shí)間為 46h，發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為400~600r/min，通氣量為 ，發(fā)酵液密度為 1000kg/m3,粘度為 s。年操作日 300 天，每升發(fā)酵液可以純化得到 Bt 產(chǎn)品 ，共需生產(chǎn) 150 個(gè)周期。水蒸氣 170℃，冷卻水進(jìn)出口溫度根據(jù)實(shí)際情況確定。 各設(shè)備的物料衡算 發(fā)酵罐中成分 啤酒糟 1000g， ，米粉 15g ，豆粕 180g ，KH2P03 2g 水占 60% 密度為 1000kg/ 3m 發(fā)酵罐物料衡算 每周期發(fā)酵體積： =3?總v32m裝料系數(shù) 取 =~6/0V?0?30?選用三個(gè) 10m3的發(fā)酵罐，另選一個(gè)作為備用罐發(fā)酵液 G=1000x10=10000kg啤酒糟 =10000x =米粉 =10000x =50kg2豆粕 =10000x =