【文章內(nèi)容簡介】 ，因此，必須采用一些方法來避免這些問題。如果有可能的話，直接將樣品在強濃度的變性液中變性，如8M尿素、10%TCA、或2%SDS（3438）來抑制蛋白酶。在低溫的時候，蛋白酶的活性低，因此，建議在樣品制備時盡可能地在低溫下進行。此外，許多蛋白酶在pH 9以上就失活了，因此，Tris堿、碳酸鈉或堿性載體兩性電解質(zhì)存在的條件下往往能抑制蛋白水解。單獨使用這些方法來抑制蛋白水解已足夠了，然而有些蛋白酶甚至在這些條件下仍然保持著活性，在這種情況下應當使用蛋白酶抑制劑。每一種蛋白酶抑制劑只對某一類蛋白酶起作用，因此，建議復合使用蛋白酶抑制劑，有多種廣譜蛋白酶抑制劑“雞尾酒”。表6提供了常用的抑制劑及抑制的蛋白酶。請參照［12，28，3640］獲得關(guān)于蛋白酶抑制的更多方面知識。表6. 蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑有效的抑制的酶缺點PMSF很常用的抑制劑，使用濃度為1mM。PMSF是不可逆抑制劑，能抑制：■ 絲氨酸水解酶?！?一些半胱氨酸水解酶。PMSF在含水溶液中很快失活，需在使用前現(xiàn)配。PMSF在含有巰基試劑（DTT或2巰基乙醇）時效果不好。這種缺點可以通過將樣品在含有PMSF而無巰基去污劑的溶液中克服，含巰基去污劑可以在其后加入。PMSF毒性相當大。AEBSF絲氨酸抑制劑（Aminoethyl benzylsulfonyl fluoride或Pefabloc SC）使用濃度為4 mM。AEBSF在抑制活性上與PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低。AEBSF具有修飾能力，會改變蛋白的pI值。1mM EDTA,1mM EGTA通常在1mM濃度使用。通過螯合蛋白酶維持活性所必需的金屬離子，這些混合物能抑制金屬蛋白酶，多肽水解蛋白酶抑制劑（如 leupeptin, pepstatin, aprotinin和bestatin）這些抑制劑：■ 不可逆抑制劑。■ 在有DTT存在下作用。■ 在不同條件下低濃度作用。使用濃度220μg/ml。亮肽素（Leupeptin）能抑制多種絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶。抑肽素（Pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶。抑肽酶（Aprotinin）能抑制許多絲氨酸蛋白酶。苯丁抑制劑（Bestatin）能抑制氨基酸多肽酶。多肽蛋白酶抑制劑價格昂貴。多肽蛋白酶抑制劑是小分子多肽，因此有可能在雙向電泳結(jié)果中出現(xiàn)，根據(jù)其分子大小范圍被第二向凝膠分離。抑肽素（Pepstatin）在pH為9時不能起抑制作用。TLCK,TPCK(對甲苯磺酰基賴氨酸氯甲基酮, 苯磺?；嚢彼崧燃谆?。這兩種相近的化合物不可逆地抑制絲氨酸和半胱氨酸的蛋白酶。芐脒（Benzamidine）使用濃度13mM。Benzamidine抑制絲氨酸蛋白酶。 蛋白質(zhì)沉淀進行雙向電泳過程中，蛋白質(zhì)沉淀是可選的步驟。蛋白質(zhì)沉淀被用來從污染雜質(zhì)（如鹽、去污劑、核酸、脂類等）中有選擇性地分離蛋白質(zhì)，否則這些污染雜質(zhì)能影響雙向電泳的結(jié)果。此后再將沉淀物溶在樣品液中。這種方法也能從稀濃度來源液（植物組織，尿）中濃縮樣品。沒有一種沉淀方法是十全十美的，有時一些蛋白質(zhì)沉淀后不能在隨后的樣品重新溶中溶解。因此，在樣品制備中使用沉淀方法有可能改變樣品蛋白的成分。如果雙向電泳想要完全和精確地得到樣品中的蛋白質(zhì)，避免使用沉淀和重溶的方法。表7列出了一些可用的沉淀方法。若在樣品處理中要使用蛋白質(zhì)沉淀方法，一般只用一種沉淀方法。從參考文獻118和44可更全面了解蛋白沉淀方法。表7. 蛋白沉淀沉淀方法一般過程缺點硫酸銨沉淀法在存在高濃度鹽時，蛋白質(zhì)有可能結(jié)合起來并從溶液中沉淀出來，許多種潛在的污染物（核酸）將會留在溶液中。在含有EDTA的緩沖液中（50mM）處理蛋白質(zhì)，最終蛋白濃度大于1mg/ml。慢慢地將硫酸銨加至需要的百分飽度，并且攪拌1030分鐘，利用離心將蛋白質(zhì)分離。許多的蛋白質(zhì)仍然留在高鹽濃度的溶液中，若想得到所有蛋白質(zhì)，這種方法不可取。然而它可以用來進行預分離和蛋白質(zhì)富集。殘留的硫酸銨能影響等電聚焦，因此，必須除去有關(guān)鹽離子。TCA沉淀TCA是一種相當有效的蛋白質(zhì)沉淀劑。在提取物中加入TCA，使之最終濃度為1020%，并且在冰浴中沉淀30分鐘（46）。也可以將組織直接在1020%的TCA中粉碎，這種方法可以限制蛋白質(zhì)水解和其它蛋白修飾作用，離心并用丙酮或乙醇洗去殘留的TCA。蛋白質(zhì)可能很難再溶或完全不能再溶。用丙酮或乙醇將殘留的TCA充分洗凈。長時間地將樣品暴露于這種低pH值溶液中，能引起蛋白質(zhì)降解和修飾。丙酮沉淀法這種有機溶劑常用來沉淀蛋白質(zhì)。許多溶于有機溶劑的污染物（去污劑、脂類）留在溶液中。在提取物中加入3倍體積的預冷丙酮，使蛋白質(zhì)在20℃條件下沉淀2小時。用離心法收集蛋白質(zhì)，通過空氣干燥或冷凍干燥除去殘留的丙酮。TCA的丙酮溶液沉淀蛋白在雙向電泳樣品制備過程中 ，往往用TCA和丙酮的混合物來沉淀蛋白，這種方法比單獨使用TCA或丙酮效果好。將破碎或裂解的樣品懸在含有20 mM % 2巰基乙醇的10%TCA溶液中。在20℃條件下沉淀蛋白質(zhì)至少45分鐘，用離心方法收集蛋白沉淀，%巰基乙醇或20 mMDTT的預冷丙酮溶液清洗。通過空氣干燥或冷凍干燥除去殘留的丙酮（5, 28, 34, 43, 51, 52）。蛋白質(zhì)可能很難重新溶解或完全不能重溶。長時間地將樣品處于這種低pH值的溶液中能使一些蛋白降解或修飾。乙酸銨的甲醇溶液沉淀蛋白質(zhì)并且用酚抽提這種方法在處理含有大量干擾物質(zhì)的植物樣品中被證明是有用的。樣品中的蛋白能被抽提進入水或緩沖液飽和的酚中，用含有乙酸銨的甲醇溶液清洗沉淀數(shù)次，然后用丙酮清洗，將殘留的丙酮蒸發(fā)掉。這種方法很復雜并很費時。 除去影響雙向電泳結(jié)果的污染物在樣品中的非蛋白雜質(zhì)能夠影響蛋白質(zhì)分離和隨后的雙向電泳結(jié)果的顯影。因此，樣品制備時可包含幾步來除去這些雜質(zhì)。表8列出了影響雙向電泳結(jié)果的物質(zhì)以及除去的方法。參考文獻15 對去除干擾物質(zhì)有進一步探討。表8. 影響雙向電泳的污染物污染物除雜原因除雜技術(shù)樣品制備過程中帶來的鹽、殘留在緩沖液和其它帶電小分子鹽能影響電泳，因此必須除去，或盡可能地使其保持較低濃度。IPG膠條中的鹽能增加膠條的電導。在離子移到膠條的兩端前，蛋白質(zhì)聚焦將不能發(fā)生，這樣延長了等電聚焦所需時間，也能引起水的流動，從而使膠條的一端腫脹而另一端變干。在膠條中的鹽能引起膠條兩端很大一塊區(qū)域內(nèi)蛋白沒有聚焦（在最終的結(jié)果中表現(xiàn)為水平拖尾或空白）。若要將樣品在IPG干膠條再水化時加樣，再水化液中的鹽濃度應當?shù)陀?0mM。若樣品在樣品杯中加樣，在樣品中高達50mM的鹽濃度是可以容忍的，然而，由于蛋白質(zhì)迅速向低鹽濃度的區(qū)域移動，在樣品加樣點蛋白質(zhì)有可能發(fā)生沉淀。可以通過下列方法除鹽：■ 透析■ 旋轉(zhuǎn)透析■ 凝膠過濾■ 沉淀/重懸法透析法是相當有效的除鹽方法，樣品的損失量小。然而，這過程需要大量時間并且需要樣品體積較大。旋轉(zhuǎn)透析法速度較快，但存在著透析膜吸附蛋白的問題。旋轉(zhuǎn)透析法應該在加尿素和去污劑前進行。 凝膠過濾可以采用，但往往產(chǎn)生蛋白丟失。 沉淀/重懸法是除去鹽和其它污染物相當有效的方法，但它也會產(chǎn)生蛋白丟失。內(nèi)源性的帶電小分子(核苷、代謝物、 磷脂等)在任何樣品溶解液中都存在著內(nèi)源性帶電小分子。這些物質(zhì)往往帶有負電荷，在正極端能引起蛋白聚焦不完全。TCA/丙酮沉淀法對除去這些物質(zhì)相當有效，也可以利用其它去鹽技術(shù)。離子去污劑離子去污劑（通常是SDS）常常在蛋白質(zhì)提取和溶解過程中使用，但是對等電聚焦的影響特別大，除非SDS除去或?qū)DS分離。SDS能與蛋白質(zhì)復合，并產(chǎn)生帶負電荷的復合物，不能正常的聚焦。在含有兩性電解質(zhì)或非離子去污劑（CHAPS、Tritonx100或NP40）%或更低，并且使其它的去污劑和SDS的比例為8:1［27］。丙酮沉淀能部分除去SDS。在室溫下沉淀能除去SDS最有效但蛋白在20℃沉淀更徹底。核酸（DNA，RNA）核酸能增加樣品的粘度，并且能產(chǎn)生背景污染。高分子量的核酸能堵塞凝膠孔隙。核酸能與蛋白質(zhì)通過靜電反應的結(jié)合，阻礙聚焦。若將分離的樣品用銀染，核酸也能被染色，這樣在第二向膠產(chǎn)生背景污染。富含核酸的樣品用不含蛋白酶的DNase/Rnase混合物使核酸降解成單核苷酸或寡核苷酸。、冰上孵育。注意：DNase和RNase蛋白有可能在雙向電泳圖譜中出現(xiàn)。超離心技術(shù)能將大分子的核酸除去，然而這種方法也能使大分子量的蛋白質(zhì)除去。在低離子強度提取條件下，帶負電的核酸有可能與帶正電的蛋白質(zhì)形成復合物。強離子強度或高pH值的提取液能減少這種反應（注意在提取過程中加入的鹽必需隨后除去）。多糖多糖會阻塞凝膠孔，引起沉淀或延長聚焦時間，導致水平拖尾。一些帶負電的多糖可和蛋白通過靜電作用結(jié)合。用TCA、硫酸銨或酚/乙酸銨沉淀，再離心。超離心會除去高分子量多糖。采用與阻止蛋白核酸相互作用相同的方法也很有用（將樣品溶入SDS中或高Ph溶液中）。脂類（lipids）許多種蛋白質(zhì)，尤其是膜蛋白能與脂類結(jié)合，這樣既降低可溶性又能影響pH值和分子量。脂類與去污染劑成復合物，降低去污劑的作用。當將富脂組織離心后，常見到一層脂質(zhì)層，很難被除去。強變性條件和去污劑能減少蛋白質(zhì)—脂類反應。需要過量的去污劑。利用丙酮沉淀法能除去一些脂類。酚類化合物(Phenolic Compounds)酚類化合物存在于植物組織中，能通過酶催化氧化反應修飾蛋白質(zhì)（43, 49）。在組織提取過程中，可以利用還原劑（DTT、2巰基乙醇、亞硫酸鹽、抗壞血酸鹽等）來防止酚類氧化物。利用沉淀技術(shù)能迅速將蛋白質(zhì)從酚類化合物中分開。利用二乙基二硫代氨基甲酸（Diethyldithiocarbamic acid）或硫脲（Thiourea）等抑制劑抑制多酚氧化酶的作用。利用PVP或PVPP吸附劑的吸附將酚類化合物除去。不溶物質(zhì)不溶物質(zhì)能堵塞凝膠空隙，使聚焦質(zhì)量下降。使用樣品杯加樣時，不溶物質(zhì)尤其是個問題，它能阻礙蛋白質(zhì)進入IPG膠條。在進行第一向等電聚焦（IEF）前用離心法將樣品純化。 樣品溶液的組成為了取得良好聚焦的第一向分離，樣品蛋白必須充分解聚，并完全溶解。不管樣品是否是較粗的裂解物或經(jīng)過了樣品沉淀過程，樣品溶液必須含有某些成份，確保在進行第一向等電聚焦（IEF）前，使樣品完全溶解和變性。這往往包括尿素以及一種或多種去污染劑。在附錄中的細胞裂解液中（溶液A）含有尿素和兼性離子去污劑CHAPS，發(fā)現(xiàn)對許多種類的樣品具有很好溶解作用。還原劑和IPG緩沖溶液經(jīng)常被加入到樣品溶液中，以提高樣品的溶解度。在變性條件下進行等電聚焦（IEF）能得到最好的分離和最清晰的結(jié)果。尿素是一種中性的促溶劑，在雙向電泳的第一向中被用作變性劑。在雙向電泳第一向樣品溶液中經(jīng)常含有尿素，其濃度為8 M。尿素能使許多種蛋白溶解并展開來形成完全隨機的結(jié)構(gòu)，所有的離子基團暴露在溶液中。除了尿素，硫脲最近被發(fā)現(xiàn)能提高蛋白質(zhì)的溶解度，尤其是膜蛋白(10, 16, 5456)。為了確保樣品的完全溶解和防止通過疏水反應而使蛋白質(zhì)相互結(jié)合，在樣品溶液中往往包含非離子或兼性離子去污劑。原先使用NP40和Triton X100這兩種相近的非離子去污劑。后來的研究證明，兼性去污劑CHAPS的效果更好(57)。有一些新的兼性離子去污劑據(jù)報道可提高膜蛋白的溶解性(58, 59)。當使樣品完全溶解發(fā)生困難時，陰離子去污劑SDS能被用做促溶劑。SDS是一種相當有效的蛋白質(zhì)促溶劑，但它由于能與蛋白質(zhì)形成復合物并且?guī)ж撾娦裕陔p向電泳中，不能只使用這種去污劑來溶解樣品。普遍使用的去除SDS干擾的方法是將樣品在含有過量的CHAPS 、Triton X100或NP40的溶液中稀釋。%或更低，過量的去污劑和SDS的比例至少為8：1(27，34，60)。為了打斷二硫鍵，并且使所有蛋白質(zhì)處于還原狀態(tài)，在樣品溶液中往往加入還原劑。經(jīng)常使用的還原劑為DTT，使用濃度為20—100mM之間。DTE與DTT相近，也能用作還原劑。原先，2巰基乙醇被用作還原劑，但是需要高濃度的還原劑，所以內(nèi)含的雜質(zhì)可能引起污染（61）。最近，非巰基還原劑TBP（Tributyl phosphine）被用作雙向電泳樣品的還原劑，使用濃度為2 mM（62）。但是TBP溶解性差和在溶液中不穩(wěn)定，如果在樣品制備時使用，需要巰基還原劑如DTT在再水化和第一向等電聚焦時維持蛋白處于還原狀態(tài)。載體兩性電解質(zhì)或 IPG緩沖液（達2%（ v/v））可包含在樣品溶解液中。通過電荷與電荷之間的反應減少蛋白質(zhì)結(jié)合來增加蛋白質(zhì)的可溶性。有時候當需要堿性條件更完全溶解蛋白或抑制蛋白水解，可加入緩沖液和堿(如40 mM Tris堿)。但是引入離子成分會影響第一向結(jié)果，堿或緩沖液在第一向等電聚焦前要稀釋到5 mM。樣品在離心和隨后的上樣之前，應當將樣品保留在樣品溶液中在室溫下維持至少30 min，使之充分變性和溶解。在有去污劑存在的樣品，加熱能促進樣品的溶解，但是，只有在加入尿素之前才能加熱，超聲波能加快蛋白質(zhì)溶解，尤其是來源于那些相當難溶材料的樣品。廣泛使用的樣品溶解液在附錄（溶液A）中給出。為進一步了解雙向電泳蛋白溶解，可閱讀參考文獻 15。224。 當你在首次對未知樣品進實驗時，建議你使用以下的樣品溶液：將蛋白溶解在：8M尿素，4%CHAPS, 60 mM DTT, 2% Pharmalyte 310, %溴酚藍。 溶解大蛋白或疏水蛋白量更難溶的蛋白可以使用以下方法： 7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS, 60M DTT, 2% Pharmalyte pH 310, %溴酚藍。 為了從蛋白含量很低并且含有大量干擾物質(zhì)的組織（如植物組織）中制備樣品，你可以使用以下推薦方法。該方法產(chǎn)生的蛋白溶液中不包含鹽