【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 染色特征的細(xì)菌習(xí)慣上被稱(chēng)為抗酸菌 (acidfast bacillus, AFB)。目前，除結(jié)核分枝桿菌以外 (臨床上最常見(jiàn)的分枝桿菌 )，發(fā)現(xiàn)的分枝桿菌種類(lèi)已達(dá) 100 余種。當(dāng)然，除分枝桿菌屬的細(xì)菌以外，還有少數(shù)細(xì)菌具有抗酸染色特征，但抗酸性較弱。 萋尼氏 (ZN)染色法基本原理是：抗酸菌具有耐受酸性介質(zhì)脫色的生物性狀。此類(lèi)細(xì)菌在石炭酸（苯酚）的協(xié)同作用下，被復(fù)紅染色劑著色，能夠耐受酸性酒精脫色，顯微鏡觀察 時(shí)保持紅色；而其它脫落細(xì)胞或標(biāo)本中的非抗酸菌被酸性酒精脫色后，可被復(fù)染劑亞甲蘭染為藍(lán)色。 AFB抗酸染色特性還與菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性有著密切聯(lián)系。 當(dāng)患者標(biāo)本直接進(jìn)行涂片鏡檢時(shí)，能夠發(fā)現(xiàn)分枝桿菌形態(tài)變化較多。結(jié)核分枝桿菌多數(shù)為桿狀、稍彎曲；菌體寬度 ～ ；菌體長(zhǎng)度不一，在 ～8um 之間，多數(shù)在 ～ ；少數(shù)菌體較長(zhǎng)者可呈螺旋狀；染色良好的結(jié)核分枝桿菌菌體內(nèi)，能夠發(fā)現(xiàn)著色較深的異染顆粒。含結(jié)核分枝桿菌較多的新鮮標(biāo)本經(jīng)萋尼氏染色， 100油鏡觀察，既能發(fā)現(xiàn)單個(gè)存在的細(xì)菌、也能看到聚集成簇或分枝狀排列的細(xì)菌。 (二 ) 熒光染色顯微鏡檢查法 ： 同萋－尼染色顯微鏡檢查法 。 （ 1） 玻片經(jīng)火焰固定后，滴加染色劑蓋滿(mǎn)玻片，染色 30 分鐘；流水自玻片一端輕緩沖洗，洗去染色液，瀝去玻片上剩余的水。 （ 2） 痰膜上端外緣滴加脫色劑， 蓋滿(mǎn)玻片 ． ． ． ． ，脫色 3分鐘或至無(wú)色，流水自玻片一端輕洗，洗去脫色劑。 （ 3） 加復(fù)染劑復(fù)染 1 分鐘，瀝去復(fù)染液，流水自玻片一端輕洗，自然干燥后鏡檢。 （ 4） 染色液配制方法詳見(jiàn)附件 3。 玻片放置在玻片臺(tái)上并以卡尺固定后，首先以 10目鏡、 20物鏡進(jìn)行鏡檢，發(fā)現(xiàn)疑為 AFB的熒光桿狀 物質(zhì)，使用 40物鏡確認(rèn)。在暗背景下，抗酸菌發(fā)出黃色熒光，呈桿狀略彎曲。 ： （ 1） 結(jié)果分級(jí)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)： 熒光染色抗酸桿菌陰性 ()： 0條 /50視野； 熒光染色抗酸桿菌陽(yáng)性 (報(bào)告抗酸菌數(shù) )： 1～ 9條 /50 視野； 熒光染色抗酸桿菌陽(yáng)性 (1+)： 10～ 49條 /50 視野； 熒光染色抗酸桿菌陽(yáng)性 (2+)： 1～ 9 條抗酸菌 /1視野； 熒光染色抗酸桿菌陽(yáng)性 (3+)： 10～ 99條抗酸菌 /1 視野； 熒光染色抗酸桿菌陽(yáng)性 (4+)： 100 條及以上抗酸菌 /1 視野。 （ 2） 、報(bào)告 2＋至少觀察 50個(gè)視野， 3+及以上 的陽(yáng)性結(jié)果至少觀察 20個(gè)視野。 (三 ) 玻片的保存 萋尼氏染色玻片閱讀完畢后，應(yīng)及時(shí)用擦鏡紙輕輕在涂片上揭取數(shù)次，徹底去除玻片上的鏡油。經(jīng)脫油、干燥后的玻片，按實(shí)驗(yàn)室序號(hào)及涂片編號(hào)放置在玻片盒中，存放在陰涼干燥的環(huán)境中避光保存，以備復(fù)檢或質(zhì)控抽檢。 熒光染色的玻片，玻片盒中放置干燥劑后密封放置在 4℃ 冰箱避光保存。 熒光染色的涂片進(jìn)行盲法復(fù)檢復(fù)核時(shí)，應(yīng)首先將復(fù)檢涂片脫色后進(jìn)行萋尼氏染色后，重新閱讀。 四、抗酸菌痰檢注意事項(xiàng) （一）涂片染色鏡檢制備注意事項(xiàng) 1. 一張載玻片上只能涂抹一份痰標(biāo)本。 2. 每張載玻片只能使用一 次，不得清洗后再次用于 AFB 涂片檢查。 3. 涂抹后的痰膜不能太厚或者太薄，透過(guò)痰膜看報(bào)紙上的 5號(hào)字時(shí)，字跡較模糊為適宜的厚度；看不見(jiàn) 5號(hào)字或很清晰，則表明該玻片涂抹過(guò)厚或過(guò)薄。 4. 由于香柏油 (cedarwood oil)能夠溶解復(fù)紅染料，使萋尼氏染色褪色，并且容易干燥凝結(jié)，對(duì)油鏡頭造成損害；故禁止使用香柏油，必需使用顯微鏡專(zhuān)用的鏡油（英文名： Immersion oil, for microscopy）。鏡油折射系數(shù)（ RI）應(yīng)大于 ， 20℃黏度系數(shù)應(yīng)在 100120mPas之間。 5. 采用熒光染色法鏡檢 AFB，只限 于那些工作量較大 (每人日讀片數(shù)超過(guò) 25張 )、具備熒光顯微鏡、且鏡檢人員接受過(guò)熒光染色鏡檢培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。 6. 采用熒光染色時(shí)，熒光隨著時(shí)間而衰減。故熒光染色后的涂片應(yīng)于當(dāng)日鏡檢；如果玻片數(shù)量過(guò)多，應(yīng)將涂片放置于 4℃避光保存，次日必須完成鏡檢。 （二） AFB痰檢假陽(yáng)性結(jié)果的預(yù)防措施 1． 必須使用新玻片進(jìn)行涂片檢查。 2． 每個(gè)標(biāo)本均使用一個(gè)新竹簽完成制片涂抹。 3． 所有染液均經(jīng)過(guò)濾。 4． 染色時(shí)玻片彼此保持一定距離，相互徹底分隔開(kāi)。 5． 嚴(yán)禁使用染色缸染色。 6． 染色時(shí)勿使玻片上的染液干燥。 7． 滴加染色液或鏡油時(shí)，避免容器滴口直接接觸痰膜 。 8． 嚴(yán)禁物鏡鏡頭直接接觸痰膜。 9． 作為對(duì)照，可采用已知結(jié)果為陰性的玻片完成染色鏡檢過(guò)程。 10． 完整、準(zhǔn)確的標(biāo)注痰盒、玻片和登記實(shí)驗(yàn)登記本。 11． 登記前、后對(duì)檢驗(yàn)單和標(biāo)本盒上的標(biāo)注進(jìn)行仔細(xì)核對(duì)。 12． 準(zhǔn)確記錄和報(bào)告結(jié)果。 （三） AFB痰檢假陰性結(jié)果的預(yù)防措施 確認(rèn)標(biāo)本是痰而非唾液。 確認(rèn)每份標(biāo)本至少有 3ml。 選擇膿樣、干酪樣、粘液分泌物涂抹制備玻片。 制備玻片時(shí)標(biāo)本涂抹均勻，不要太厚或太薄。 使用高質(zhì)量染料、嚴(yán)格按照配方配制染液。 嚴(yán)格按照操作程序完成染色過(guò)程。 判斷結(jié)果為“陰性”前，必須閱讀 規(guī)定要求的視野數(shù)。 作為對(duì)照，可采用已知結(jié)果為陽(yáng)性的玻片，完成染色 鏡檢過(guò)程。 完整、準(zhǔn)確的標(biāo)注痰盒、玻片和實(shí)驗(yàn)登記本。 登記前對(duì)檢驗(yàn)單和標(biāo)本盒上的標(biāo)注進(jìn)行仔細(xì)核對(duì)。 1準(zhǔn)確記錄和報(bào)告結(jié)果。 第五節(jié)顯微鏡的使用、維護(hù)和保養(yǎng) 顯微鏡作為結(jié)核病防治工作中的重要設(shè)備，實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)正確使用并給予日常維護(hù)，以保證其正常工作和延長(zhǎng)使用壽命。在使用和維護(hù)顯微鏡時(shí)應(yīng)特別遵守下列要點(diǎn)： 一、一般原則 （一）顯微鏡是精密儀器，所以應(yīng)注意 小心操作，避免任何撞擊。 移動(dòng)顯微鏡使用雙手，一手托于顯微鏡 底部，一手握顯微鏡臂。 不要自行拆開(kāi)顯微鏡。 不要將可拆卸的目鏡或其他光學(xué)部件摔落。 避免振動(dòng)、過(guò)熱、日光直射、潮濕以及灰塵。 （二）如有灰塵或有濺出的鏡油弄臟顯微鏡，應(yīng)立即清理 清潔顯微鏡表面：用柔軟的紗布沾少量中性清潔劑清潔。 清潔目鏡內(nèi)部的鏡頭或聚光器：用鏡頭紙或柔軟的干布擦拭。（這些鏡頭經(jīng)常是用光學(xué)塑料做成，溶劑可能會(huì)使鏡頭變得模糊）。 清潔物鏡：使用鏡頭紙或柔軟的干布清潔（使用溶劑可能會(huì)使粘附鏡片的膠溶解）。 只有當(dāng)清潔諸如目鏡外部鏡頭等玻璃部件時(shí)，可以用柔軟的紗布沾取少量溶劑（乙醚與 乙醇的混合物，體積比為 8： 2或 7： 3）擦拭。 必須注意：目前光學(xué)塑料被用于越來(lái)越 多的部件中，所以在顯微鏡的清潔中不使用溶劑是最安全 的。 應(yīng)該特別注意灰塵，可以用橡皮吸球輕輕吹掉，也可以使用柔軟的刷子清潔。 （三）在潮熱地區(qū)，可能會(huì)生長(zhǎng)霉菌，破壞顯微鏡的光學(xué)部件。為了避免霉菌生長(zhǎng)，可以將顯微鏡罩好，再將其放在用 1－ 2個(gè) 40瓦燈泡加熱的柜櫥內(nèi)或放置在空氣流通處。在這樣的地區(qū)，顯微鏡不能放在木箱中過(guò)夜。近來(lái)某些品牌的顯微鏡附帶抗真菌裝置，安裝在顯微鏡的內(nèi)部。 （四）為避免劃痕或留下纖維，只能使用鏡頭紙或軟布清潔光學(xué) 部分，而不能使用普通紙巾或棉花。 （五）顯微鏡只能由接受過(guò)專(zhuān)門(mén)培訓(xùn)的技術(shù)人員拆卸。不能常規(guī)地打開(kāi)顯微鏡進(jìn)行清潔，除去目鏡清潔鏡頭足以使灰塵和真菌的孢子穿透并附著在棱鏡上。同樣地，如果移去物鏡頭進(jìn)行修理或更換，應(yīng)該用顯微鏡廠家提供的塑料塞封住物鏡轉(zhuǎn)換器上的孔洞。 二、日常維護(hù) 安穩(wěn)水平放置顯微鏡。 除去表面的灰塵。 檢查顯微鏡上的灰塵和油漬，如果需要，按上述方法清潔。 檢查物鏡是否擦拭（有的人可能會(huì)將顯微鏡的物鏡浸到鏡油）。 使用后應(yīng)關(guān)閉顯微鏡電源（適用于電光源的顯微鏡）。 待顯微鏡燈 泡及其周?chē)糠殖浞掷鋮s后拔除電源線(xiàn)。 蓋好顯微鏡并存放好。 三、維修和保養(yǎng) 如上所述，只有經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)培訓(xùn)的技術(shù)人員才可以進(jìn)行顯微鏡的維修和超出上述范圍以外的保養(yǎng)。未經(jīng)專(zhuān)門(mén)培訓(xùn)的人員所能進(jìn)行的唯一“維修”操作是更換破損的燈泡： 更換燈泡前，關(guān)閉顯微鏡電源，待顯微鏡燈泡及其周?chē)糠殖浞掷鋮s后拔除電源線(xiàn)。 如果必須倒轉(zhuǎn)顯微鏡以觸到燈泡部分，應(yīng)先拔下目鏡頭，否則目鏡可能掉落。 確認(rèn)你選擇了正確的燈泡：查看顯微鏡說(shuō)明書(shū)中的詳細(xì)說(shuō)明。 正確更換新燈泡：現(xiàn)在許多顯微鏡裝有鹵素?zé)襞荩ê苄〉枪β屎軓?qiáng)）。這些鹵素?zé)襞輹?huì)變得很熱，因此一定不要用手觸摸，因?yàn)樵跓襞莸墓ぷ鳒囟认?，即使很少的油脂也?huì)和玻璃起反應(yīng)，并使燈泡破損。所以，當(dāng)更換鹵素?zé)襞? 時(shí)，要使其一直在塑料袋中進(jìn)行操作，當(dāng)燈泡安裝到位后才能除去塑料袋。如果這樣的燈泡被手指接觸，或經(jīng)其他途徑被弄臟，應(yīng)使用紗布浸少許酒精擦拭，并在干燥后安裝。 打開(kāi)燈泡小室的蓋子。 安裝新燈泡（如果是鹵素?zé)襞菘蓪襞莶迥_插入針孔，或者將其他燈泡旋轉(zhuǎn)入位）。 關(guān)閉燈泡小室的蓋子。 插上顯微鏡電源試用。 第六節(jié)試劑和材料 為保障痰涂片鏡檢工作的連續(xù)性，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù) 實(shí)際工作負(fù)荷儲(chǔ)存一定數(shù)量的實(shí)驗(yàn)耗材和相應(yīng)試劑，儲(chǔ)備量一般應(yīng)比平均工作量高 20％作為緩沖。每檢查 1000 份標(biāo)本所試劑消耗和應(yīng)該儲(chǔ)備的耗材和試劑見(jiàn)表 1： 表 1 實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備耗材 (每檢查 1000 份標(biāo)本 ) 材料、試劑名稱(chēng) 實(shí)際用量 需要儲(chǔ)備量 備注 痰盒 1000 個(gè) 1200 個(gè) 竹簽 1000 個(gè) 1200 個(gè) 載玻片 1000 張 1200 張 鏡油 100 ml 120 ml 復(fù)紅染色液 3000 ml 3600 ml 每張玻片需染色液、復(fù)染液各約 3ml，需脫色液約 6ml； 亞甲蘭復(fù)染液 3000 ml 3600 ml 濃鹽酸 ? 300 ml 360 ml 95%酒精 ? 5700 ml 7000 ml 石碳酸 135 g 162 g 金胺 O 染色液 (如使用熒光染色 ) 3000 ml 3600 ml 高錳酸鉀復(fù)染液 (如使用熒光染色 ) 3000 ml 3600 ml 定性濾紙 6 張 擦鏡紙 2 本 玻片盒 (100 張 /盒 ) 10 個(gè) ? 鹽酸、酒精的消耗量根據(jù)脫色情況調(diào)整。 第三章痰涂片顯微鏡檢查質(zhì)量保證 實(shí)施質(zhì)量保證工作對(duì)于持續(xù)提高結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室痰涂片檢查的工 作效率和可靠性非常重要。質(zhì)量保證 (Quality Assurance, QA)包括三個(gè)方面： 室內(nèi)質(zhì)量控制 (Quality Control， QC)、 室間質(zhì)量評(píng)估（ External Quality Assessment, EQA）、質(zhì)量提高（ Quality Improvement, QI）。 按照 國(guó)家結(jié)核病防治規(guī)劃 的要求以及 WHO的建議，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的基礎(chǔ)上，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)量檢查和評(píng)估的方法，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，并通過(guò)采取一系列措施不斷改進(jìn)和提高實(shí)驗(yàn)室服務(wù)的總體水平。必須依靠全國(guó)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保 證系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)?，F(xiàn)將我國(guó)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)及職能、質(zhì)量保證工作介紹如下。 第一節(jié)實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)及職能 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證依賴(lài)于完整的實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)以及網(wǎng)絡(luò)中各級(jí)實(shí)驗(yàn)室是否能夠有效地發(fā)揮各自職能。 一、 結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò) 圖４ 結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò) 二、質(zhì)量保證體系中各級(jí)實(shí)驗(yàn)室職能 （一）國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室 根據(jù)國(guó)家結(jié)核病防制規(guī)劃的要求，組織全國(guó)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室的工作，制定和推行結(jié)核病細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化準(zhǔn)操作規(guī)程及規(guī)章制度。 建立可行的全國(guó)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量保證系統(tǒng)，并負(fù)責(zé)組織、實(shí)施。 指導(dǎo)、協(xié)調(diào)、檢查各省 （市、自治區(qū)）結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作，為全國(guó)各級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室服務(wù)提供技術(shù)支持。 對(duì)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施、設(shè)備、耗材的技術(shù)指標(biāo)及質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。 參與跨國(guó)參比實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量評(píng)估。 （二）?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）級(jí)結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室 按照國(guó)家和省結(jié)核病防制規(guī)劃的要求，在國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室的統(tǒng)一部署下，規(guī)劃本省結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作，制定實(shí)施措施，協(xié)調(diào)、指導(dǎo)省內(nèi)各級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作并提供技術(shù)支持。 根據(jù)國(guó)家結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證體系的要求，組織全省各級(jí)實(shí)驗(yàn)室痰涂片鏡檢的質(zhì)量保證工作，按要求對(duì)所轄的地市、縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行督導(dǎo)和評(píng)估，指 導(dǎo)地市級(jí)實(shí)驗(yàn)室對(duì)各縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室的盲法復(fù)檢和現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估。 對(duì)本省結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室所用耗材、試劑的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估和核準(zhǔn)。建議省級(jí)參比室為全省統(tǒng)一提供抗酸染色試劑，為省內(nèi)開(kāi)展分離培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一提供培養(yǎng)基。 負(fù)責(zé)組織、實(shí)施本省結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證相關(guān)的培訓(xùn)工作。 接受?chē)?guó)家參比實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量評(píng)估，按有關(guān)規(guī)定上報(bào)各類(lèi)表格。 （三）地（市）級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室 在省級(jí)參比實(shí)驗(yàn)室的指導(dǎo)下，制定本地（市）結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室工作計(jì)劃。 根據(jù)國(guó)家結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證體系的要求，組織實(shí)施本地市痰涂片鏡檢的盲法復(fù)檢和現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估，并按要求 向省參比實(shí)驗(yàn)室報(bào)告結(jié)果。 對(duì)縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室以及鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院查痰點(diǎn)提供技術(shù)支持。在省級(jí)參比室難以統(tǒng)一提供抗酸染色試劑時(shí)，協(xié)助省級(jí)為轄區(qū)內(nèi)的痰涂片檢查實(shí)驗(yàn)室提供抗酸染色液。 培訓(xùn)所轄縣（市）結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員，監(jiān)督轄區(qū)內(nèi)檢驗(yàn)人員培訓(xùn)后上崗制度。 接受省級(jí)參比室的質(zhì)量控制、技術(shù)培訓(xùn)和現(xiàn)場(chǎng)督導(dǎo)。