【文章內(nèi)容簡介】 生光分解反應(yīng)。N亞硝胺因分子量不同，表現(xiàn)出蒸汽壓大小的差異。能夠被水蒸氣蒸餾出來不需經(jīng)衍生化可直接進行氣相色譜測定的稱為揮發(fā)性亞硝胺。N亞硝酰胺類和非揮發(fā)性的強極性亞硝胺（如N亞硝基二乙醇胺NDElA、N亞硝基脯氨酸NPRO、N亞硝基羥脯氨酸NHPRO、N亞硝基肌氨酸NSAR等）均不能用水蒸氣蒸餾方法與基質(zhì)分開，被稱為非揮發(fā)性N亞硝基化合物。這可以作為設(shè)計分析方法的依據(jù)。 N亞硝基化合物的來源 自然界存在的N亞硝基化合物不多，但在食品及人體內(nèi)普遍存在形成N亞硝基化合物的前體物質(zhì)，它們在一定條件下可合成一定量的N亞硝基化合物。N亞硝基化合物是N亞硝化劑和可亞硝化的含氮化合物在一定條件下經(jīng)亞硝化作用合成的，該過程在環(huán)境和體內(nèi)均可進行，可能的反應(yīng)過程如圖73。仲胺 N亞硝胺 酰胺 N亞硝酰胺圖73 N亞硝基化合物的合成反應(yīng)這一反應(yīng)與反應(yīng)物濃度、氫離子濃度、胺的種類及有無催化劑等密切相關(guān)。除反應(yīng)物濃度以外，氫離子濃度對反應(yīng)有著重要影響。一般在酸性條件下最容易發(fā)生反應(yīng)，～。胺的種類與亞硝化程度也有關(guān)系，一般仲胺反應(yīng)速度快，伯胺、叔胺反應(yīng)很困難，但在硫氰酸根存在時，伯胺和亞硝酸的反應(yīng)也很快。維生素C、維生素E、酚類物質(zhì)可抑制N亞硝基化合物的形成。N亞硝化劑和可亞硝化的含氮化合物稱為N亞硝基化合物的前體。N亞硝化劑包括亞硝酸鹽和硝酸鹽以及其他氮氧化物，還包括與鹵素離子或硫氰酸鹽產(chǎn)生的復合物?？蓙喯趸暮衔镏饕婕鞍贰被?、多肽、脲、脲烷、呱啶、酰胺等。（1）硝酸鹽和亞硝酸鹽的來源 食品是硝酸鹽（nitrates）和亞硝酸鹽（nitrites）的主要來源。膳食中硝酸鹽和亞硝酸鹽來源很多，主要包括以下方面。①用作食品添加劑是直接來源 硝酸鹽和亞硝酸鹽是允許用于肉及肉制品生產(chǎn)加工中的發(fā)色劑和防腐劑。②肥料等的大量使用是主要來源 由于含氮肥料（土壤缺錳、鉬等微量元素時更嚴重）和農(nóng)藥的使用、工業(yè)廢水和生活污水的排放等，使得硝酸鹽廣泛存在于自然環(huán)境（水、土壤和植物）中。微生物的根瘤菌及植物的固氮作用，構(gòu)成了植物體硝酸鹽的重要來源。③硝酸鹽和亞硝酸鹽的體內(nèi)轉(zhuǎn)化與合成 研究表明，植物體中的硝酸鹽和攝入人體的硝酸鹽都可以在各自體內(nèi)硝酸鹽還原酶的作用下轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽；硝酸鹽和亞硝酸鹽還可以由機體內(nèi)源性形成，已經(jīng)證實機體每天可以恒定產(chǎn)生大約85mg硝酸鈉。機體內(nèi)存在一氧化氮合酶，可將精氨酸轉(zhuǎn)化成為一氧化氮和瓜氨酸，一氧化氮可以形成過氧化氮，后者與水作用釋放亞硝酸鹽。（2）可亞硝化的含氮化合物的來源 人類食物中廣泛存在可以亞硝化的含氮有機化合物，主要涉及伯胺、仲胺、芳胺、氨基酸、多肽、脲、脲烷、呱啶、酰胺、脒、肼、酰肼、腈酰胺、腙、羥胺等。作為食品天然成分的蛋白質(zhì)、氨基酸和磷脂，都可以是胺和酰胺的前體物，或者本身就是可亞硝化的含氮化合物。另外，許多胺類也是藥物、化學農(nóng)藥（特別是氨基甲酸酯類）和一些化工產(chǎn)品的原料，它們也有可能作為N亞硝基化合物的前體物。3. N亞硝基化合物污染的來源（1）食品中的N亞硝基化合物 N亞硝基化合物的前體物廣泛存在于食品中，在食品加工過程中易轉(zhuǎn)化成N亞硝基化合物。據(jù)目前已有的研究結(jié)果，以下食品中含有較多的N亞硝基化合物。①魚類及肉制品 魚和肉類食物中，本身含有少量的胺類，但在腌制和烘烤加工過程中，尤其是油煎烹調(diào)時，能分解出一些胺類化合物。腐爛變質(zhì)的魚和肉類，可分解產(chǎn)生大量的胺類，其中包括二甲胺、三甲胺、脯氨酸、腐胺、脂肪族聚胺、精胺、吡咯烷、氨基乙酰1甘氨酸和膠原蛋白等。這些化合物與添加的亞硝酸鹽等作用生成亞硝胺。腌制食品如果再用煙熏，則N亞硝基化合物的含量將會更高。②蔬菜和瓜果 植物類食品中含有較多的硝酸鹽和亞硝酸鹽，蔬菜等在加工處理（如腌制）和貯藏過程中，硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，并與食品中蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物胺反應(yīng)，生成微量的N亞硝基化合物，～kg1范圍內(nèi)。③啤酒 大麥芽在窖內(nèi)用明火直接加熱干燥過程中，空氣中的氮被高溫氧化成氮氧化物，其作為亞硝化劑與大麥芽中的胺類〔大麥芽堿（hordenine）、蘆竹堿（gramine）、禾胺等〕及發(fā)芽時形成的大麥醇溶蛋白反應(yīng)形成NDMA。④乳制品 干奶酪，奶粉、奶酒等乳制品中，存在微量的揮發(fā)性亞硝胺。其形成機制與啤酒中的N亞硝基化合物形成相同，是奶粉在干燥過程中產(chǎn)生的?！玨g1范圍內(nèi)。⑤霉變食品 霉變食品中也有亞硝基化合物的存在，某些霉菌可引起霉變糧食及其制品中亞硝酸鹽及胺類物質(zhì)的增高，為亞硝基化合物的合成創(chuàng)造了物質(zhì)條件。（2）N亞硝基化合物的內(nèi)源性合成 研究表明，按照“圖3－10 N亞硝基化合物的合成反應(yīng)”途徑，在人和動物體內(nèi)均可內(nèi)源性合成N亞硝基化合物。人體合成亞硝胺的部位主要有口腔、胃和膀胱。每天由唾液分泌的亞硝酸鹽約9mg，在不注意口腔衛(wèi)生時，口腔內(nèi)殘余的食物在微生物的作用下發(fā)生分解并產(chǎn)生胺類，這些胺類和亞硝酸鹽反應(yīng)可生成亞硝胺，而唾液成分中的硫氰酸根可加速這一反應(yīng)的進程；胃酸使胃內(nèi)呈酸性環(huán)境，為亞硝胺的合成提供了條件，而胃液的重要成分氯離子也會影響N亞硝基化合物的形成。但正常情況下，胃內(nèi)合成的亞硝胺不是很多，而在胃酸缺乏如慢性萎縮性胃炎時，胃液pH值增高，細菌可以增長繁殖，硝酸還原菌將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，腐敗菌等雜菌將蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生胺類，使合成亞硝胺的前體物增多，有利于亞硝胺在胃內(nèi)的合成；當泌尿系統(tǒng)感染時，在膀胱內(nèi)也可以合成亞硝基化合物。 N亞硝基化合物的危害性不同種類的亞硝基化合物，其毒性大小差別很大，大多數(shù)亞硝基化合物屬于低毒和中等毒，個別屬于高毒甚至劇毒（如表71）?；衔锊煌涠咀饔脵C理也不盡相同，其中肝損傷較多見，也有腎損傷、血管損傷等。 表71 部分N亞硝基化合物的LD50（大鼠，經(jīng)口）/（mgkg1體重） 化 合 物LD50化 合 物LD50二甲基亞硝胺27～41甲基苯基亞硝胺200二乙基亞硝胺216～280甲基芐基亞硝胺18二正丙基亞硝胺480亞硝基嗎啉282～320二正丁基亞硝胺1200甲基亞硝基脲180二正戊甲基亞硝胺1750甲基亞硝基脲烷240甲基正丁基亞硝胺130亞硝基乙基甲烯亞胺336甲基特丁基亞硝胺700亞硝基庚基甲烯亞胺283乙基正丁基亞硝胺380亞硝基辛基甲烯亞胺566乙基特丁基亞硝胺1600亞硝基吡咯烷900乙基2羥乙基亞硝胺＞75亞硝基哌啶200二2羥乙基亞硝胺＞6000許多動物實驗證明，N亞硝基化合物具有致癌作用。N亞硝胺相對穩(wěn)定，需要在體內(nèi)代謝成為活性物質(zhì)才具備致癌、致突變性，稱為前致癌物。而N亞硝酰胺類不穩(wěn)定，能夠在作用部位直接降解成重氮化合物，并與DNA結(jié)合發(fā)揮直接致癌、致突變性，因此稱N亞硝酰胺是終末致癌物。迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)一種動物對N亞硝基化合物的致癌作用有抵抗力，不僅如此，多種給藥途徑均能引起實驗動物的腫瘤發(fā)生，不論經(jīng)呼吸道吸入，消化道攝入，皮下和肌肉注射，還是皮膚接觸都可誘發(fā)腫瘤。反復多次接觸，或一次大劑量給藥都能誘發(fā)腫瘤，都有劑量效應(yīng)關(guān)系。器官特異性是N亞硝基化合物致癌的重要特征，不同化合物有不同的靶器官，這主要和化合物的結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。最多見的是肝、食管及胃癌；肺、膀胱及鼻咽癌偶爾也可見到。如對稱性亞硝胺（如N二甲基亞硝胺NDMA）主要誘發(fā)肝癌，而不對稱性亞硝胺（如N甲基芐亞硝胺NMBzA）主要誘發(fā)食道癌。一些含氧的環(huán)狀亞硝胺，如嗎啉硝胺3惡嗪能引起大鼠肝臟腫瘤，而2，6二甲基中嗎啉亞硝胺是很強的食管致癌物?？梢哉f，在動物實驗方面，N亞硝基化合物的致癌作用證據(jù)充分。在人類流行病學方面，從某些國家和地區(qū)流行病學資料的分析，表明人類某些癌癥可能與之有關(guān)，如智利胃癌高發(fā)可能與硝酸鹽肥料大量使用，從而造成土壤中硝酸鹽與亞硝酸鹽過高有關(guān)。日本人愛吃咸魚和咸菜，其胃癌發(fā)病率較高，前者胺類特別是仲胺與叔胺較高，后者亞硝酸鹽與硝酸鹽含量較多。我國林縣食管癌高發(fā)，也被認為與當?shù)厥称分衼喯醢窓z出率較高（％，％）有關(guān)。、致突變作用在遺傳毒性研究中發(fā)現(xiàn)許多N亞硝基化合物可以通過機體代謝或直接作用，誘發(fā)基因突變、染色體異常和DNA修復障礙。如亞硝酰胺能引起仔鼠產(chǎn)生腦、眼、肋骨和脊柱的畸形，而亞硝胺致畸作用很弱。二甲基亞硝胺具有致突變作用，常用作致突變試驗的陽性對照。N亞硝胺類的檢測隨著分析儀器的進步而不斷發(fā)展。早期有薄層色譜法、高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜法（GC）；近年來發(fā)展有GCTEA（氣相色譜熱能分析）、GCNPD（氣相色譜氮磷檢測器法）、GCMS（氣相色譜質(zhì)譜儀法）、HPLCMS/MS和離子阱GCMS法等。以下對GCTEA和GCMS國標方法進行介紹。（1）原理 試樣中N亞硝胺經(jīng)硅藻土吸附或真空低溫蒸餾，用二氯甲烷提取、分離，氣相色譜熱能分析儀（GCTEA）測定。其原理如下：自氣相色譜儀分離后的亞硝胺在熱解室中經(jīng)特異性催化裂解產(chǎn)生NO基團，后者與臭氧反應(yīng)生成激發(fā)態(tài)NO*。當激發(fā)態(tài)NO*返回基態(tài)時發(fā)射出近紅外區(qū)光線（600～2800nm）。產(chǎn)生的近紅外區(qū)光線被光電倍增管檢測（600～800nm）。由于特異性催化裂解與冷阱或CTR過濾器除去雜質(zhì)，使熱能分析儀僅僅能檢測NO基團，而成為亞硝胺特異性檢測器。（2）測定方法 測定方法包括提取、濃縮和試樣測定三步。①提取 有兩種不同的提取方法。甲法（硅藻土吸附）：，加1ml氫氧化鈉溶液（1molL1）和1ml N亞硝基二丙胺內(nèi)標工作液（200μgL1），混勻后備用。將12gExtrelut干法填于層析柱中，用手敲實。將啤酒試樣裝于柱頂。平衡10～15 min后，用65ml二氯甲烷直接洗脫提取。乙法（真空低溫蒸餾）：，4ml氫氧化鈉溶液（1molL1），混勻后連接好蒸餾裝置。 真空度低溫蒸餾，待試樣剩余10ml左右時，直至試樣蒸至近干為止。把蒸餾液移入250ml分液漏斗，加4ml鹽酸（L1），用20ml二氯甲烷提取三次，每次3min，合并提取液。用10g無水硫酸鈉脫水。②濃縮 將二氯甲烷提取液轉(zhuǎn)移至KD濃縮器中，于55℃水浴上濃縮至10ml，～，備用。③試樣測定 在確定氣相色譜條件和熱能分析儀條件的基礎(chǔ)上進行測定。氣相色譜條件：氣化室溫度：220℃；色譜柱溫度：175℃或從75℃以5℃min1速度升至175℃后維持；色譜柱：內(nèi)徑2～3mm，長2～3m玻璃柱或不銹鋼柱，內(nèi)裝涂以固定液10%（m/m）聚乙二醇20molL1和氫氧化鉀（10gL1）13%（m/m）Carbowax 20M/TPA于載體Chromosorb W AWDMCS（80～100目）；載氣：氬氣，流速20～40mlmin1。熱能分析儀條件：接口溫度：250℃；熱解室溫度：500℃；真空度：133～266Pa；冷阱：用液氮調(diào)至150℃（可用CTR過濾器代替）。測定：分別注入試樣濃縮液和N亞硝胺標準工作液5～10μL，利用保留時間定性，峰高或峰面積定量。（3）計算 試樣中N亞硝基二甲胺的含量按公式（7－8）進行計算。 （7－8）式中：X—試樣中N亞硝基二甲胺的含量，μgkg1；h1—試樣濃縮液中N亞硝基二甲胺的峰高或峰面積；mm或mm2；h2—標準工作液中N亞硝基二甲胺的峰高或峰面積，mm或mm2；c—標準工作液中N亞硝基二甲胺的濃度，μgL1；V1—試樣濃縮液的進樣體積，μl；V2—標準工作液的進樣體積，μl；V—試樣濃縮液的濃縮體積，μl；m—試樣的質(zhì)量，g。 （1）原理 試樣中的N亞硝胺類化合物經(jīng)水蒸氣蒸餾和有機溶劑萃取后，濃縮至一定量，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的高分辨峰匹配法進行確認和定量。（2）測定方法 包括水蒸氣蒸餾、萃取純化、濃縮和試樣測定四步。①水蒸氣蒸餾 稱取200g切碎（或絞碎、粉碎）后的試樣，置于水蒸氣蒸餾裝置的蒸餾瓶中（液體試樣直接量取200ml），加入100ml水（液體試樣不加水），搖勻。在蒸餾瓶中加入120g氯化鈉，充分搖動，使氯化鈉溶解。將蒸餾瓶與水蒸氣發(fā)生器及冷凝器連接好，并在錐形接收瓶中加入40ml二氯甲烷及少量冰塊，收集400ml餾出液。 ②萃取純化 在錐形接收瓶中加入80g氯化鈉和3ml的硫酸（1＋3），攪拌使氯化鈉完全溶解。然后轉(zhuǎn)移到500ml分液漏斗中，振蕩5min，靜止分層，將二氯甲烷層分至另一錐形瓶中，再用120ml二氯甲烷分三次提取水層，合并四次提取液，總體積為160ml。對于含有較高濃度乙醇的試樣，如蒸餾酒、配制酒等，須用50ml氫氧化鈉溶液（120gL1）洗有機層兩次，以除去乙醇的干擾。 ③濃縮 將有機層用10g無水硫酸鈉脫水后，轉(zhuǎn)移至KD濃縮器中，加入一粒耐火磚顆粒，于50℃水浴上濃縮至1ml。備用。④試樣測定 在確定色譜條件和質(zhì)譜儀條件的基礎(chǔ)上進行測定。色譜條件：氣化室溫度：190℃；色譜柱溫度：對N亞硝基二甲胺、N亞硝基二乙胺、N亞硝基二丙胺和N亞硝基吡咯烷分別為1℃；色譜柱：～，長2m的玻璃柱，內(nèi)裝涂以15%（m/m）PEG20M固定液和氫氧化鉀溶液（10gL1）的80～100目Chromosorb W AW DWCS；載氣：氦氣；流速為40mlmin1。質(zhì)譜儀條件：分辨率：≥7000；離子化電壓：70V；離子化電流：300μA；離子源溫度：180℃；離子源真空度：104Pa；界面溫度：180℃。測定：采用電子轟擊源高分辨峰匹配法，用全氟煤油（PFK）的碎片離子（、）分