環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌新型試劑盒研制可行性研究報(bào)告(編輯修改稿)
2025-06-10 08:26 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 開(kāi)發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的病原菌檢測(cè)試劑盒。項(xiàng)目完成時(shí)達(dá)到的技術(shù)水平項(xiàng)目完成時(shí)，開(kāi)發(fā)的多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌技術(shù)及其配套試劑盒達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。（二）項(xiàng)目技術(shù)方案技術(shù)方案（1）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)常見(jiàn)病原菌方法的建立①常見(jiàn)病原菌特異性LAMP引物的設(shè)計(jì)。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的常見(jiàn)病原菌DNA序列，采用LAMP專(zhuān)用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性LAMP引物（包括每類(lèi)致病菌的兩個(gè)外引物、兩個(gè)內(nèi)引物和兩個(gè)環(huán)引物，其中每個(gè)內(nèi)引物均具有兩段能夠識(shí)別靶分子上特定位點(diǎn)的序列，以保證靶序列的特異性擴(kuò)增。）②常見(jiàn)病原菌基因組DNA的提取。采用本實(shí)驗(yàn)室建立的基因組DNA快速提取技術(shù)提取致病菌DNA。③LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化：對(duì)引物濃度、內(nèi)引物和外引物的最佳濃度比、模板濃度、dNTP濃度、BstDNA聚合酶用量、Mg2+濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化。④溫育條件的優(yōu)化：在5565℃之間優(yōu)化等溫?cái)U(kuò)增溫度。⑤擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：建立快速顯色法和電泳分析法兩種檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。⑥以上述研究結(jié)果為基礎(chǔ)，建立常見(jiàn)病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)技術(shù)。（2）常見(jiàn)病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的靈敏度分析將常見(jiàn)病原菌目標(biāo)基因克隆至pMD18T載體，轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，倍比稀釋成含目的基因拷貝數(shù)為10101010101，以其為模板做環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)本方法的靈敏度。（3）常見(jiàn)病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的特異性分析分別以病原菌和非病原菌基因組DNA為模板做環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)本方法的特異性。（4）常見(jiàn)病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法及常規(guī)PCR擴(kuò)增方法比較分析以LAMP的兩個(gè)外引物做常規(guī)PCR擴(kuò)增，并與LAMP的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較分析，進(jìn)一步判斷LAMP技術(shù)的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。（5）常見(jiàn)病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法在食品檢測(cè)和臨床診斷中的應(yīng)用研究 將本方法應(yīng)用于食品檢測(cè)和臨床診斷中，分析本方法對(duì)不同樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確率。（6）病原菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒的研制根據(jù)本項(xiàng)目所建立的LAMP最佳反應(yīng)體系和LAMP反應(yīng)產(chǎn)物顯示方法，研制開(kāi)發(fā)快速檢測(cè)病原菌的試劑盒（包括單一病原菌檢測(cè)試劑盒和多種病原菌同時(shí)檢測(cè)試劑盒）。工藝流程引物優(yōu)化、組合LAMP反應(yīng)體系的建立靈敏度試驗(yàn)特異性試驗(yàn)反應(yīng)條件優(yōu)化陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照試劑盒中試同類(lèi)產(chǎn)品比較試驗(yàn)國(guó)標(biāo)法比較試驗(yàn)LAMP方法應(yīng)用于病原體檢測(cè)樣品收集核酸提取引物設(shè)計(jì)基因序列分析（三）項(xiàng)目技術(shù)質(zhì)量指標(biāo)（1）本項(xiàng)目建立的方法對(duì)病原菌檢測(cè)的準(zhǔn)確率達(dá)到95%。（2）本項(xiàng)目建立的方法對(duì)病原菌目的基因檢測(cè)的靈敏度達(dá)到101拷貝。（3）本項(xiàng)目建立的方法不產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。（4）對(duì)病原菌目的基因的等溫?cái)U(kuò)增過(guò)程在3060分鐘內(nèi)完成，顯色法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物在5分鐘內(nèi)完成，電泳法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物在60分鐘內(nèi)完成。（四）項(xiàng)目執(zhí)行過(guò)程中各階段目標(biāo)2007年度第一季度：設(shè)計(jì)引物，引物合成，購(gòu)買(mǎi)實(shí)驗(yàn)菌株和有關(guān)試劑，完善實(shí)驗(yàn)條件。第二季度：樣品采集，病原菌DNA提取。 第三季度：等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)化，溫育條件優(yōu)化。第四季度：擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)方法的建立（快速顯色法、電泳分析法）。2008年度第一季度：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌方法操作程序確定，多重等溫?cái)U(kuò)增同時(shí)檢測(cè)多種病原菌實(shí)驗(yàn)技術(shù)建立。第二季度：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌方法的準(zhǔn)確度分析。第三季度：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌方法的靈敏度分析。第四季度：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌方法與常規(guī)PCR擴(kuò)增方法比較分析。2009年度第一季度：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和多重等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌方法在食品和臨床標(biāo)本上的應(yīng)用及效果分析。第二季度：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)病原菌試劑盒和多重等溫?cái)U(kuò)增試劑盒研制。第三季度：試劑盒的應(yīng)用及技術(shù)推廣。第四季度：課題總結(jié)，鑒定。（五）項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)預(yù)算情況本項(xiàng)目申請(qǐng)科研經(jīng)費(fèi)5萬(wàn)元。其中設(shè)備、儀器購(gòu)置費(fèi)1萬(wàn)元；材料；；資料；實(shí)驗(yàn)、檢測(cè)費(fèi)2萬(wàn)元；。三、項(xiàng)目實(shí)施支撐條件項(xiàng)目技術(shù)來(lái)源本項(xiàng)目的技術(shù)由項(xiàng)目申請(qǐng)人建立。項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)、檢測(cè)條件項(xiàng)目申請(qǐng)人所在學(xué)院—生命科學(xué)學(xué)院擁有食品科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科、生物化學(xué)與分子生物學(xué)省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科和食品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。這些重點(diǎn)學(xué)科和重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)施完善、先進(jìn)，具有進(jìn)行本項(xiàng)目研究的實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地，為本項(xiàng)目的完成提供了保障。項(xiàng)目申請(qǐng)人所在的江西省生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)條件先進(jìn)，具有PE9700型PCR儀，全自動(dòng)DNA測(cè)序儀（ABI Prism 3100型）、高速冷凍離心機(jī)、超速冷凍離心機(jī)、超低溫冰箱、MilliQ超純水系統(tǒng)、各種規(guī)格的電泳儀、紫外分光光度計(jì)、設(shè)施先進(jìn)的細(xì)菌培養(yǎng)室等儀器設(shè)備?，F(xiàn)已完成了本項(xiàng)目所需的科研平臺(tái)建設(shè)工作。項(xiàng)目申請(qǐng)人長(zhǎng)期從事分子生物學(xué)研究工作，熟練掌握了分子生物學(xué)研究技術(shù)。課題組已開(kāi)展了本項(xiàng)目的前期研究工作，目前正在進(jìn)行嗜水單胞菌和金黃色葡萄球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增研究，基本掌握了等溫?cái)U(kuò)增專(zhuān)用引物設(shè)計(jì)軟件的使用和等溫?cái)U(kuò)增的操作要點(diǎn)，這為本項(xiàng)目的順利完成奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。項(xiàng)目申請(qǐng)單位人才資源情況項(xiàng)目申請(qǐng)單位南昌大學(xué)是我省唯一一所省部共建的“211”工程重點(diǎn)建設(shè)大學(xué)，人才資源豐富，科研力量雄厚。
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