【文章內(nèi)容簡介】 顯癥的樹藤作為樣本，克服了在發(fā)病初期不易發(fā)現(xiàn)和分離該菌的困難，并詳細(xì)介紹了該菌的特異探針、引物及反應(yīng)條件的設(shè)計(jì)方法，具有較高的參考價(jià)值。 第三節(jié) 植物病害鑒定與檢測實(shí)例 ? Fire blight of pear ? Stewart’s bacterial wilt of corn ? Citrus Huanglongbing ? Coconut Lethal Yellowing 梨火疫病 Fire blight of pear 1878年首先由 Burrill描述，在紐約發(fā)生，后由 Erwin命名，是第一個(gè)被確定的植物細(xì)菌病害。 主要分布于北美洲于西北歐，中歐、地中海、東南歐及大洋州和亞洲也有分布。大約 40多個(gè)國家。 梨火疫病的地理分布 ?寄主： 梨火疫病菌寄主范圍很廣，能為害梨、蘋果、山楂、木旬子、李等 40多個(gè)屬 220多種植物，大部分屬薔薇科 危害性： 仁果類果樹的一種毀滅性病害。一棵多年生的梨和蘋果樹發(fā)病后可在幾星期內(nèi)死亡。 ?癥狀： ? 侵害花、果實(shí)、枝條和葉片。 ? 花： 侵染后變深褐色，枯萎。 ? 葉片： 從葉緣沿葉脈擴(kuò)展，先呈水浸狀，后黑褐色。 ? 嫩稍： 先水浸狀，后褐色至黑色，向下彎曲，呈魚鉤狀。 ? 果實(shí)： 病部褐色凹陷，擴(kuò)展到全果，潮濕時(shí)病部生粘稠的細(xì)菌溢，初乳白色，后紅褐色。 ? 病枝： 葉片凋萎，幼果僵化，但病葉病果不脫落，遠(yuǎn)望似火燒狀，故稱火疫病。 ? 傷口： 初期水浸狀，后下陷，呈潰瘍斑，病健交界處產(chǎn)生龜裂紋，韌皮部紅褐色，有黏液狀菌膿。 ? 嚴(yán)重時(shí)，病害從嫩稍很快擴(kuò)展到枝條、主干，直至根部，全株死亡。 Pear fire blight, Erwinia amylovora Advanced fire blight on fruit note bacterial ooze on fruit. ?主要鑒定特征： 梨火疫病最典型的癥狀是花、果實(shí)和葉片受火疫病菌侵害后，很快變黑褐色枯萎，猶如火燒一般，但仍掛在樹上不落，故此得名。 目前國際上將其癥狀據(jù)受侵害的部位，分成５個(gè)階段。 （ 1）花枯萎：侵染開放的花引起花枯萎。一般發(fā)生于早春，病菌直接從花器侵入，初為水漬狀斑，花基部或花柄暗色，不久萎蔫。 （ 2）潰瘍枯萎：是指前一季越冬潰瘍邊緣的病菌重新復(fù)活的結(jié)果。 （ 3）枝枯萎：細(xì)菌直接侵入前 1～ 3葉的枝尖，然后殺死整個(gè)枝條及支持枝。 （ 4）病菌亦可直接從氣孔、水孔等自然孔口或蕾苞，或由風(fēng)引起的傷口侵入葉片，初葉邊壞死，并向中脈、中柄、莖擴(kuò)展，后變黑，通常有菌膿。 （ 5）損傷枯萎和砧木枯萎：前者主要是由于晚霜、冰雹或大風(fēng)損傷引起，如果實(shí) 很容易引起果實(shí)枯萎。后者僅限于高感品種 EMAL2 EMLA9和 MARK39砧木。通常是由感病的接穗在這些砧木上發(fā)病后引起，最終成潰瘍帶而殺死樹體。 ?病原菌： 學(xué)名： Erwinia amylovora（ Burrill） Winslow 異名： Micrococcus amylovorus Burril Bacillus amylovorus (Burrill) Trevisan Bacterium amylovorus (Burrill) Chester 分類地位： 原核生物界 (Procaryotes),薄壁菌門(Gracilicutes),腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)歐文氏菌屬(Erwinia)解淀粉歐文氏菌 ?形態(tài)特征： ? 直桿菌，有莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，大小為 ，多數(shù)單生，有時(shí)成雙或短時(shí)間內(nèi) 34個(gè)呈鏈狀。革蘭氏染色陰性。 ? 在蔗糖培養(yǎng)基上 27℃ 下培養(yǎng) 3d，菌落直徑 3～ 4mm，白色至奶油色，半球形隆起，有黏性，表面光滑，邊緣整齊，中心絨環(huán)狀。 ?生物學(xué)特性： ? 兼性厭氧，過氧化物酶陽性，氧化酶陰性， 好氣條件 下利用葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣， 厭氧條件 產(chǎn)酸緩慢。 ? 明膠碟形液化緩慢。不產(chǎn)生硫化氫，不利用丙二酸鹽。葡萄糖酸鹽氧化和七葉苷水解不穩(wěn)定。 ? 氯化鈉濃度高于 2％以上時(shí)生長延緩，至 6％－ 7%時(shí)則完全抑制。抗青霉素，對氯霉素、鏈霉素和土霉素敏感。 細(xì)菌生長的溫度范圍 6～ 37 ℃ ，最適溫度 25～ ℃ ，致死溫度 45～ 50℃ ， 10 min，最適酸堿度為 。 梨火疫病菌以簡單的細(xì)胞分裂繁殖，一個(gè)細(xì)胞在條件適宜時(shí)，３天內(nèi)在寄主植物組織中能達(dá)到 109細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞都是一個(gè)侵染源，感染寄主而引起病害的發(fā)展。 除 蛋白酶 外，病菌不產(chǎn)任何有助于侵入寄主的酶，主要是在環(huán)境條件適宜時(shí)，通過胞間組織侵入薄壁組織的病菌產(chǎn)生胞外多糖。 胞外多糖 在病害發(fā)展過程中起重要的作用，其是菌膿的重要成份。 菌膿 的理化性質(zhì)隨濕度變化而變化，干時(shí)皺、硬，大時(shí)膨脹易被雨水?dāng)U散，中等濕度的菌膿粘易被昆蟲、風(fēng)傳播。 ?發(fā)病規(guī)律： ? 病菌在 病株病疤邊緣組織處越冬 ，掛在樹上的病果也是越冬場所，如果冬季溫和，病菌還能在病株樹皮上度過，來年早春病菌在上年的潰瘍處迅速繁殖，遇到潮濕、溫和的天氣，從病部滲出大量乳白色粘稠狀的細(xì)菌分泌物，即為當(dāng)年的初侵染源，通過 昆蟲、雨滴、風(fēng)、鳥類以及人 的田間操作將病菌傳給健株。 ? 病菌亦通過 傷口、自然孔口 （氣孔、蜜腺、水孔）、 花 侵入寄主組織，有一定損傷的花、葉、幼果和茂盛的嫩枝最易感病。 ? 傳播途徑 ① 近距離傳播： 雨水是果園短距離傳播的主要因子，其次風(fēng)亦是中短距離傳播的重要因子，往往在沿著盛行風(fēng)的方向，病原菌被風(fēng)攜帶到較遠(yuǎn)距離。除次之外，昆蟲對病菌的傳播擴(kuò)散起一定的作用。傳病昆蟲包括蜜蜂在內(nèi)有 77個(gè)屬的 100多種昆蟲，其中密蜂的傳病距離約為 200 ~ 400 m 。 ② 遠(yuǎn)距離傳播： 主要是感病寄主繁殖材料，包括種苗、接穗、砧木、水果、被污染的運(yùn)輸工具、候鳥等。 梨火疫病的遠(yuǎn)距離傳播 ?發(fā)生條件： 受傷的花朵、幼果和嫩稍最易受病菌侵染。 經(jīng)冰雹襲擊，病害蔓延更加迅速。 較高氣溫（ 18～ 24℃ ）和較高的濕度（ 70％以上）有利于病菌侵染。 ?檢驗(yàn)方法： 1. 產(chǎn)地檢驗(yàn)： 2. 癥狀觀察： 梨火疫病的癥狀很典型，是鑒定的重要方法，但必須與其他癥狀相似的梨梢枯病區(qū)分開。 梨梢枯病僅限于危害花器、葉片和嫩梢，不危害枝條和莖干，病部無細(xì)菌溢膿，葉片上最初為深褐色斑點(diǎn)，周圍有紅色暈圈，枯死的病葉不會長期掛在樹上 可采用選擇性培養(yǎng)基和鑒別性培養(yǎng)基進(jìn)行。 MS培養(yǎng)基 菌落為紅橙色，背景為蘭綠色 。 ? 配方：瓊脂 20g，甘露醇 10g， L天門冬酰胺 3g，牛膽酸鈉 ，磷酸氫二鉀 ，煙酸 ， MgSO4〃7H ，次氮基三乙酸 ，硫酸十七烷基鈉 ， %溴麝香草酚蘭水溶液 9ml， %中性紅 ，蒸餾水 970ml， 1%放線菌酮 5ml， 1%硝酸銫水溶液 。 CG培養(yǎng)基 在 29℃ 培養(yǎng) 48小時(shí)后形成 典型的火山口狀菌落 。 ? 配方：水 380ml，蔗糖 160g，營養(yǎng)瓊脂 12g，結(jié)晶紫 （ 1%乙醇溶液），%放線菌酮 20ml。 TTC培養(yǎng)基 ： 該培養(yǎng)基是 Weise(1981)設(shè)計(jì)的四氮銼 福美聯(lián)培養(yǎng)基。梨火疫病菌在 27℃ 培養(yǎng) 2～ 3天后，可產(chǎn)生 紅色肉疣狀菌落 。 配方 ： 營養(yǎng)瓊脂 37