體外受精與核移植動(dòng)物(編輯修改稿)
2025-05-29 06:21 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ） （ 3） （ 4） （ 5） 134 核移植動(dòng)物 一 定義 細(xì)胞核移植 （ Cell nuclear transfer）是 利用顯微操作 技術(shù)將一種動(dòng)物的細(xì)胞核移入同種或異種動(dòng)物的去核 成熟卵細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)。 細(xì)胞核移植動(dòng)物 ： 是用特定發(fā)育階段的核供體及相應(yīng)的核 受體（去核的卵子）體外構(gòu)建重組胚，通過(guò)胚胎移植達(dá)到 受體，發(fā)育出生的動(dòng)物。 理論基礎(chǔ) ：動(dòng)物細(xì)胞核具有發(fā)育成個(gè)體的全能性，因此克 隆動(dòng)物可以通過(guò)細(xì)胞核移植實(shí)現(xiàn)。 但是，細(xì)胞核移植所得到的動(dòng)物為 核質(zhì)雜種 。 克隆動(dòng)物 一般指采用 核移植、胚胎移植 技術(shù)得到 的動(dòng)物。 二 核移植動(dòng)物培育技術(shù)流程 1核供體細(xì)胞的獲得與取核 2受體細(xì)胞的去核 3細(xì)胞核移植 4重組胚的激活、培養(yǎng)和移植 5核移植后代的鑒定 1 核供體細(xì)胞獲得與 取 核 供核細(xì)胞可以是 動(dòng)物原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞 。分離 制備單個(gè)動(dòng)物細(xì)胞，體外培養(yǎng)得到正常二倍體體 細(xì)胞系，然后進(jìn)行 1～ 5 天的缺血饑餓培養(yǎng) ，誘 使細(xì)胞處于 “ 靜止” 狀態(tài) （一般進(jìn)入 G0 期 ）。 采用 細(xì)胞松弛素 B（ Cytochalasin B） 誘發(fā)細(xì)胞排 核 或者 顯微操作取核 等方法得到細(xì)胞核。 2 受體細(xì)胞 去 核 （ 1）盲吸去核法 ： 用 微細(xì)玻璃管吸除 處于 MII分裂中期 的 卵細(xì)胞染色體 及周?chē)牟糠旨?xì)胞質(zhì)。 用熒光染料 Hoechst33342對(duì)卵細(xì)胞 DNA進(jìn) 行染色，在 紫外觀察下去核 可提高去核成功率。 （ 2）功能性去核法： 使用 Hoechst33342與卵細(xì)胞 DNA結(jié)合后，用 紫外線(xiàn)或激光定點(diǎn)照射使核功能喪失 。 （ 3）化學(xué)誘導(dǎo)去核法： 使用 脫羰秋水仙素 處理卵細(xì)胞 ， 迫使核染色質(zhì)全部進(jìn)入第二極體細(xì)胞 。 3 細(xì)胞核移植 細(xì)胞核移植可以采用 胞質(zhì)內(nèi)注射和透明帶下注射 方法。 前者是用微吸管吸取供體核后，直接注射進(jìn)卵子 細(xì)胞質(zhì) 。 后者是把細(xì)胞核注射進(jìn) 透明帶和卵細(xì)胞間 的 卵周 隙 中。 核移植方法 將受體 卵細(xì)胞 去核 移植后的細(xì)胞 激活 后可以象受精卵一 樣發(fā)育形成動(dòng)物個(gè) 體，并具有與核供 體細(xì)胞相同的基因 向去核卵細(xì)胞 植入 供體細(xì)胞 核 核 移 植 與 動(dòng) 物 克 隆 4 重組胚激活 正常受精卵的發(fā)育啟動(dòng)和早期卵裂主要由卵母細(xì)胞胞質(zhì) 中 母源信息 所控制， 成熟的卵母細(xì)胞質(zhì)能使移入的細(xì)胞 核在形態(tài)上和功能上發(fā)生變化，從而 導(dǎo)致供核回復(fù)到初 始狀態(tài)，基因從頭開(kāi)始順序表達(dá)。 而核移植重組胚的發(fā)育需要進(jìn)一步激活，可以采用 電激活和 化學(xué)激活 方法。 （ 1） 電激活 ：是可把重組胚放在 電融合槽兩極 之間，用 幾次 瞬時(shí)直流脈沖刺激 使其激活。 （ 2） 化學(xué)激活 ：常用的激活劑包括 7%乙醇、 SrCl放線(xiàn) 菌酮、離子霉素等。 鍶 5 重組胚培養(yǎng)和移植 激活后的重組胚可以采用 體內(nèi)和體外兩種培養(yǎng) 方式。 （ 1） 體內(nèi)培養(yǎng)： 是將重組胚移植入同種或異種受體動(dòng)物的 輸卵管發(fā)育 至 桑葚胚或囊胚期 (816 cell) ，再進(jìn)行胚胎移植至受體動(dòng)物子宮發(fā)育。 （ 2） 體外培養(yǎng)： 是將重組胚在特定 培養(yǎng)液中 培 養(yǎng)至 囊胚 ，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移入同種的 同期發(fā)情的 受體動(dòng)物 中繼續(xù)發(fā)育。 6 體細(xì)胞核移植后代的鑒定與出生 對(duì)于體細(xì)胞核移植培育的動(dòng)物，可以從 形態(tài)性別 上鑒定，還可以采用 分子生物學(xué)技術(shù) 鑒定。 三 胚胎細(xì)胞克隆動(dòng)物 五 體細(xì)胞克隆動(dòng)物 體細(xì)胞克?。?是將動(dòng)物 體細(xì)胞 經(jīng)過(guò)抑制培養(yǎng)使其 處于休眠狀態(tài)，利用 細(xì)胞核移植技術(shù) 將其導(dǎo)入去 核卵母細(xì)胞，培育成早期胚胎，將 胚胎移植 至受 體，妊娠產(chǎn)仔培育出 與核供體一樣的成體動(dòng)物 的 一種細(xì)胞工程技術(shù)。 意義： 由于體細(xì)胞數(shù)量豐富并且易于獲得，因此體細(xì)胞克隆動(dòng)物技術(shù)在 加快珍稀動(dòng)物繁殖，搶救瀕危動(dòng)物（如大熊貓），也 可以用患者本人細(xì)胞培育出 干細(xì)胞或 新組織治療 方面意義重大。 體細(xì)胞克隆 基本過(guò)程 里程碑式的突破 － 1997年，英格蘭愛(ài)丁堡羅斯林研究所和 PPL制藥公 司利用高度分化的綿羊乳腺上皮細(xì)胞，通過(guò)核移植克 隆了一只 雌性小綿羊 —— Dolly多莉 。這是 第一個(gè)體 細(xì)胞 克隆動(dòng)物 。 證明：成熟的體細(xì)胞 也具有全能性。 多莉羊技術(shù)路線(xiàn) 1核供體細(xì)胞獲得與取核 取一只 6歲已妊 娠到后期的白色的 芬蘭多特西母羊 的乳腺 組織，酶消化分解成 單個(gè)細(xì)胞 ，將這些細(xì) 胞平鋪在新鮮的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)層（滋養(yǎng)層）上培養(yǎng) 7天 ，將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移到卻乏營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)傳 代，其培養(yǎng)基的胎牛血清濃度從 10%下降至 % ，這樣使 細(xì)胞停在休止期（ G0） 。（傳到 79代 時(shí)，供體細(xì)胞可停在休止期，此時(shí)細(xì)胞染色體為 54個(gè)，是二倍體）。 在倒置顯微鏡下，用 顯微吸管將核吸出 。 2卵細(xì)胞收集與去核 受體卵細(xì)胞 來(lái)自于 蘇格蘭黑面母綿羊 ，在注射促性腺 釋放素 (GnRH)2833h時(shí)，收 集 卵細(xì)胞 。 在倒置顯微鏡的視野下用顯微吸管刺入， 吸取中期染色體和少量細(xì)胞質(zhì) 。 去核后卵細(xì)胞放在無(wú)鈣鎂，但含有 1%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液中復(fù)原 ，然后轉(zhuǎn)移到 37度無(wú)鈣、但含有 10%的胎牛血清的 M2培養(yǎng)液中保存?zhèn)溆谩? 3細(xì)胞核融入卵細(xì)胞構(gòu)建重組胚 將核和已去核卵細(xì)胞放入同一培養(yǎng)皿中，在 交變 脈沖 電壓為 3伏的 電場(chǎng)中融合 5分鐘 ，再用 /厘米， 80微秒， 直流電脈沖 3次 ， 將乳腺細(xì)胞核融入卵 中形成一個(gè) 含有新遺傳物質(zhì)的卵細(xì)胞 ，稱(chēng)之為 重組胚 。 4重構(gòu)胚的培養(yǎng)與移植 將重構(gòu)胚種植在綿羊 結(jié)扎的輸卵管中培養(yǎng) ，大約 培養(yǎng) 6天 后 ，大多數(shù)胚胎發(fā)育到 桑椹期或囊胚期（ 8－ 16個(gè)細(xì)胞 ）。 再選擇發(fā)育優(yōu)良的重構(gòu)胚移植到蘇格蘭 黑綿羊的 子宮中 ， 每只受體
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