生物樣品的預(yù)處理ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-28 13:36 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ，1%醋酸或 1%苯酚等 )； – ⑶ 提取液除雜：對于無機鹽及低分子量的有機物質(zhì)可用透析法、離子交換樹脂或凝膠過濾法除去；對于大分子雜質(zhì)可用酶消化 (如蛋白酶、木質(zhì)素酶 )，乙醇或丙酮等溶劑沉淀法或金屬絡(luò)合物法。 BioPharm 蛋白雜質(zhì)的影響及對策 ? 多糖提取液中除去蛋白質(zhì)是一個很重要的步驟，常用的方法有 – Sevag法 – 氯仿：戊醇（或正丁醇）：多糖水溶液 =5： 1： 6 – 較溫和 – 三氟三氯乙烷法 – 多糖水溶液：三氟三氯乙烷 =1： 1 – 效率高、不易大量應(yīng)用 – 三氯乙酸法 – 多糖水溶液中滴加 3%三氯乙酸 – 較劇烈，不適合含呋喃糖殘基的多糖 – 酶解法 ? 前三種方法不適合糖肽的分離 ? 三氯醋酸法和 Sevag法的脫蛋白效果相近，并且蛋白酶法與 Sevag法相結(jié)合除蛋白的效果較好。 BioPharm 動物組織預(yù)處理注意事項 ? 勻漿化前的預(yù)處理 (冷凍 ) ? 提取物緩沖液的選擇 (中性 ) ? 蛋白酶抑制劑的添加 ? 保護劑的添加 (β 巰基乙醇、 EDTA、輔酶等 ) ? 提取液的澄清 ( 高速離心、沉淀、吸附等 ) BioPharm 微生物物質(zhì)的提取制備 ? 各種發(fā)酵產(chǎn)品，由于菌種不同和發(fā)酵液特性不同，其預(yù)處理方法的選擇也有所不同。 ? 大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中，也有少數(shù)產(chǎn)物存在于菌體中，或發(fā)酵液和菌體中都含有。 ? 對于胞外產(chǎn)物，經(jīng)預(yù)處理應(yīng)盡可能使目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相，然后經(jīng)固液分離除去固相； ? 對于胞內(nèi)產(chǎn)物，則應(yīng)首先收集菌體或細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞破碎后，目的產(chǎn)物進入液相，隨后再將細(xì)胞碎片分離。 BioPharm 大腸桿菌重組蛋白的提取制備 ? 多拷貝質(zhì)粒上強啟動子過量表達重組蛋白質(zhì)使整個細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達水平提高 ,但大多情形下會導(dǎo)致諸如包含體的不溶性蛋白聚集的形成 重組菌 E. coli M15(pQE32AGN)外源基因的誘導(dǎo)表達 (A未誘導(dǎo)， B誘導(dǎo) ) BioPharm 包含體 ? 包含體（ inclusion bodies）是無定形的蛋白質(zhì)的聚集，不被任何膜所包圍。細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密，低速離心就可以沉淀。 ? 包含體難溶于水中，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能溶解。在這些溶液中，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、疏水鍵全被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級結(jié)構(gòu)和共價鍵不被破壞。因此當(dāng)除去變性劑時，一部分蛋白質(zhì)可以自動折疊成具有活性的正確構(gòu)型，這一折疊過程稱為蛋白質(zhì)的復(fù)性。 ? 包含體主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大多是基因表達產(chǎn)物。這些基因表達產(chǎn)物沒有生物活性。為此，欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。所以，包含體的出現(xiàn)增加了生化工程師生物分離設(shè)計的難度 BioPharm 重組蛋白的提取步驟 ? 大腸桿菌的酶解 – 采用溶菌酶或超聲破碎方法來破壁 ? 包含體的清洗 – 用溶劑清洗包含體能進一步除去雜蛋白 ? 從包含體中溶解重組蛋白（變性） – 選擇和優(yōu)化溶解液（一般為尿素和鹽酸胍），使包含體中重組蛋白溶解 ? 重組蛋白的復(fù)性 – 稀釋法、透析法、層析法、分子伴侶等 BioPharm 2 細(xì)胞的破碎與分離 ? 細(xì)胞的破碎： – 用一定方法（機械法、物理法、化學(xué)法、酶法等）打開細(xì)胞壁或膜，使細(xì)胞內(nèi)含物有效地釋放出來。 ? 提取： – 目的物從胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到外界溶液中。 細(xì)胞 提取劑 提取液（液體目的物）
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1