【文章內(nèi)容簡介】 rabene Ethylparabene Propylparabene Butylparabene 5 6 8 10 12 100 200 400 600 900 mAU Minutes Methylparabene Ethylparabene Propylparabene Butylparabene Pump with pulse damper Backpressure: 60 bar, 85 bar and 105 bar Variation: 2% Acclaim 120, C18, 5 181。 m, x 100 mm。 mL/min。 25176。 C。 5 181。 L injection volume。 UV detection at 256 nm。 Eluent (A) Water and (B) Acetonitril。 Gradient: 30 % b to 100 % B in 10 min。 Methyl, Ethyl, Propyl and Butylparabene, 10 mg/L each 液相色譜的檢測器 常規(guī)檢測器 示差折光檢測器（ Refractive Index） 紫外 /可見光吸收檢測器（ UVVis） 熒光檢測器（ Fluorescence） 蒸發(fā)光散射檢測器（ Evaporative Light Scattering） 其他檢測器（ Other Detectors） 高端檢測器 光電二極管矩陣檢測器（ Photodiode Array） 質(zhì)譜檢測器（ Mass Spectrometry） HPLC檢測器應(yīng)提供的功能 對樣品有響應(yīng)并有一個輸出信號 應(yīng)該提供在檢測器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計的校正技術(shù)應(yīng)該促進(jìn)這種關(guān)系 但是： 由于受 HPLC系統(tǒng)其他部件的影響會產(chǎn)生響應(yīng)與濃度之間關(guān)系的與線性偏離現(xiàn)象 并不是所有的檢測器是線性的 受 HPLC系統(tǒng)其他部件的影響，檢測器的表現(xiàn)可能與其最佳水平有較大的差距 用于 HPLC的檢測器 沒有任何一種單獨的檢測器可以適應(yīng)所有的液相色譜分離！ HPLC檢測器可以分為： 溶質(zhì)性質(zhì)檢測器（ Solute property detectors） 對溶質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)，一般不反應(yīng)流動相的變化（選擇型） 整體性質(zhì)檢測器（ Bulk property detectors） 不管是否有溶質(zhì)，對流動相任何物理性質(zhì)的變化作出響應(yīng)（通用型） 不同種類的檢測器的分類 整體性質(zhì) 示差折光檢測器 蒸發(fā)光散射檢測器 電導(dǎo)檢測器 溶質(zhì)性質(zhì) 熒光檢測器 固定波長 可變波長 光電二極管矩陣 電化學(xué)檢測器 放射化學(xué)檢測器 氮 /硫檢測器 質(zhì)譜檢測器 紫外 /可見光檢測器 理想的 HPLC檢測器 高靈敏度；可忽略的基線噪音 寬的線性范圍 獨立于流動相及操作參數(shù)的響應(yīng) 對壓力、溫度及流速等變化不敏感 長時間操作的穩(wěn)定性 低死體積 非破壞性 選擇性 靈敏度：信噪比 靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（ S/N） 檢測限（ LOD）： S/N = 3 定量限（ LOQ）： S/N = 10 好的信噪比有利于： 更好的色譜峰確認(rèn) 更好的定量 更好地完成色譜峰純度 /均一性 6:1 N S 方法開發(fā)的過程 Adapted from: Snyder, .。 Kirkland, .。 Glajch, 。 Practical HPLC Method Development 2nd Ed., WileyInterscience, New York, 1997, p. 2 1. 得到樣品信息，確定分離目標(biāo) 2. 確定特定 HPLC過程、樣品預(yù)處理等的需求 3. 選擇檢測器及其條件 4. 選擇 HPLC方法；初步分離；建立最佳分離條件 5. 優(yōu)化分離條件 6. 檢查特定過程的問題及需要 7. 定量校正 8. 日常使用的確認(rèn) 選擇液相色譜的檢測器 要考慮的因素： 你要分離的化合物 /樣品的化學(xué)特性 化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量及紫外光譜等等 流動相的影響（溶劑、緩沖鹽改性劑等） 梯度還是等度 靈敏度需求 是否有雙檢測的需求 選擇液相色譜的檢測器 通用檢測器 RI ELSD MS 靈敏度 mg ng pg 線性范圍 104 否 103 流速敏感 是 否 是 溫度敏感 是 否 否 破壞性 否 是 是 選擇性檢測器 ABS FL EC Cond MS 靈敏度 ng pg fg pg pg 線性范圍 105 103 106 105 103 流速敏感 否 否 是 是 是 溫度敏感 否 否 是 是 是 破壞性 否 否 是 否 是 可供選擇的液相色譜檢測器 Absorbance (UV/Vis) Chemiluminescence Circular Dichroism (Chiral) Conductivity Electrochemical Evaporative Light Scattering Fluorescence Laser Induced Florescence Laser Interferometer Laser Polarimeter Mass Spectrometric (LC/MS) Nitrogen Specific Detector Nuclear Magic Resonance Offline Methods Optical Rotation Detector Photo Diode Array Refractive Index Radiochemical Sulfur Specific Detector Visetry Multi Angle Light Scattering 示差折光（ Refractive Index）檢測 示差折光檢測器（ RI）是第一個商品化的液相色譜檢測器（上世紀(jì)六十年代末、七十年代初） 通常被認(rèn)為是一種通用檢測器 檢測溶液中所有被溶解的溶質(zhì) － 非特異性 任何光學(xué)介質(zhì)的折光率都被定義為光在該介質(zhì)中與真空中的速度之比值 R S 示差檢測器 － 基本原理 檢測基于被分析物的折光指數(shù)的差異 測量樣品流路與參比流路在折光指數(shù)上的差別 當(dāng)折光指數(shù)差異最大時靈敏度也達(dá)到最大 并不測量絕對的折光指數(shù)而是測定折光指數(shù)的差別（ Differential RI） 典型的應(yīng)用領(lǐng)域 沒有紫外吸收、熒光的化合物，例如： ?碳水化合物（ Carbohydrates）、聚合物（ Polymers） ?脂肪酸（ Fatty Acids）及油脂類（ Lipids） 示差檢測器的優(yōu)、缺點 優(yōu)點 通用檢測器 容易使用；通常來說是比較耐用的檢測器 維護(hù)成本低 缺點 靈敏度低、選擇性差 對流速、溫度及粘度的變化敏感 不能用于梯度方法 色譜峰可能是正的，也可能是負(fù)的 示差檢測器的優(yōu)點 － 通用性 根據(jù)隨機(jī)統(tǒng)計；任何一對液體都會有大約 折光率差異 因此；除非正好被分析的樣品與溶液的折光指數(shù)完全相同，都會被檢測到 Separation of LactoseReduce Milk MV 20 10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Minutes 葡萄糖 乳糖 半乳糖 示差檢測器的缺點 － 靈敏度 缺乏靈敏度 － 和其他檢測器相比， RI檢測器一般靈敏度較低 UV@254 nm S/N 15000:1 MV Minutes AU Refractive Index S/N ~125:1 流動相： MeOH/H2O 60:40 流速： mL/min 色譜柱： C18 色譜柱溫： 30 186。C 檢測溫度： 35 186。C 樣品： Paraben Mixture 示差檢測器的缺點 － 不適宜作梯度 流動相： A= CH3CN/H2O 75:25 B= CH3CN 流速： mL/min 色譜柱： NH2 色譜柱溫： 30 186。C 檢測溫度： 35 186。C MV 2600 2400 2200 2022 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 200 400 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 0% B 25 % B Chromatography Forum: Is RI with a Reverse Phase gradient possi