基礎(chǔ)生物學(xué)作業(yè)(編輯修改稿)
2025-05-04 03:22 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 腫瘤細(xì)胞等。在實(shí)際上應(yīng)用中應(yīng)具體根據(jù)目的條件選擇。（四）細(xì)胞轉(zhuǎn)染（tansfection）將目的基因?qū)氚屑?xì)胞的方法很多，大致可分為物理學(xué)方法、化學(xué)方法、融合法和病毒感染法四類。病毒法已在本節(jié)的“基因的轉(zhuǎn)運(yùn)”中有基因介紹。目前較多使用的是脂質(zhì)體法。 在目前的技術(shù)狀態(tài)下，一般而言其基因轉(zhuǎn)染效率很難達(dá)到100%。故必須首先將轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和未轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞加以區(qū)分。這方面的新技術(shù)發(fā)展很快，常用的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞篩選方法有：利用基因表達(dá)產(chǎn)物篩選法：（1）標(biāo)記基因篩選法：在載體上引入一個(gè)標(biāo)記基因，或同時(shí)導(dǎo)入標(biāo)記基因，在轉(zhuǎn)染后的適當(dāng)時(shí)間選用合適劑量的選擇培養(yǎng)基，篩選標(biāo)記基因表型，那些已導(dǎo)入外源基因的細(xì)胞將存活下來，而未轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞則死于選擇性細(xì)胞培養(yǎng)基。如在較多的載體中都有neor標(biāo)記基因存在，若向培養(yǎng)基中加入G418進(jìn)行選擇，最后只有轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞存活下來。（2）基因缺陷型受體細(xì)胞的選擇性：以基因缺陷型細(xì)胞作為靶細(xì)胞，將正常基因?qū)牖蛉毕菪桶屑?xì)胞后，使用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。例如將TK基因?qū)隩K的靶細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄細(xì)胞可在HAT培養(yǎng)基中生長，未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞則不能在HAT培養(yǎng)基中生長。（3）基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)：將目的基因表達(dá)載體DNA和標(biāo)記基因表達(dá)載體DNA混合后共同轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中，分別使用標(biāo)記基因和目的基因?qū)?yīng)的選擇劑進(jìn)行兩次篩選，最后得到復(fù)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)化子。分子生物學(xué)方法：外源基因是否真的轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞必須用分子雜交方法進(jìn)行證實(shí)。常用的方法有原位雜效，Southern雜交和打點(diǎn)雜交。其中主要問題是探針的選擇。若靶細(xì)胞內(nèi)原來不存在所轉(zhuǎn)入的目的基因，可選用目的基因作為探針；靶細(xì)胞內(nèi)一般無標(biāo)記基因存在，故標(biāo)記基因是良好的探針。探針大小可以是較大的DNA片段，亦可是人工合成的DNA單鏈探針分子。PCR方法目前也已用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的鑒定，且該法相對(duì)簡(jiǎn)單易行。（五）外源基因的表達(dá)及檢測(cè)在篩選出轉(zhuǎn)化分子后還需要鑒定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中外源基因的表達(dá)狀況。其中包括對(duì)目的基因和標(biāo)記基因表達(dá)的鑒定。常用方法有原位雜交，Northrn雜交，NRA打點(diǎn)雜交，免疫組織化學(xué)染色等，前幾項(xiàng)是檢測(cè)外源基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA，后者則是檢測(cè)外源基因翻譯出的蛋白質(zhì)。流式細(xì)胞儀是一種較為客觀準(zhǔn)確的儀器，可定量分析外源基因的表達(dá)狀況。選擇并制備好治療性基因、恰當(dāng)?shù)妮d體、合適的基因轉(zhuǎn)移方法及篩選方法后，就應(yīng)該選擇合適的將目的基因?qū)塍w內(nèi)的方式。將治療性基因?qū)塍w內(nèi)的途徑有兩種：in vivo和ex vivo途徑。（六）將目的基因?qū)塍w內(nèi)n vivo途徑該途徑就是指治療性基因通過一定的載體攜帶，在體情況下，直接轉(zhuǎn)導(dǎo)入人體的靶器官的靶細(xì)胞中。通常可以使用病毒載體攜帶和脂質(zhì)體包裹等方式將治療性基因?qū)肴梭w中。這種方法導(dǎo)入的基因在體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的時(shí)間通常較短暫，運(yùn)用病毒載體時(shí)，可能引起患者產(chǎn)生不良反應(yīng)，甚至發(fā)生病毒感染，因此比較危險(xiǎn)。但是對(duì)靶細(xì)胞不易體外培養(yǎng)的情況，這種方法很有效。而且，對(duì)病毒載體減毒的研究越來越多，病毒載體的危險(xiǎn)性也會(huì)越來越低。ex vivo途徑該途徑就是指取出患者體細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，將治療性基因通過病毒載體或非病毒載體轉(zhuǎn)染后，篩選成功轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，體外擴(kuò)大培養(yǎng)，再移植到患者的特定部位，通常是重新移植到細(xì)胞來源的器官和組織中。理論上講，ex vivo途徑的安全性更高，但是，該途徑的運(yùn)用范圍較受限制，只有治療用的靶細(xì)胞容易取材，容易體外培養(yǎng)、擴(kuò)增、傳代的情況下，才能使用。三、 治療癌癥的策略與應(yīng)用二十世紀(jì)八十年代基因治療技術(shù)興起以來，基因治療的研究一直在坎坷中發(fā)展，由于在理論和技術(shù)上存在許多不完善之處，因此它曾經(jīng)倍受爭(zhēng)議，并被認(rèn)為與傳統(tǒng)的倫理道德相悖，有時(shí)甚至由于一些偶然事件而被政府和權(quán)威人士明令禁止和抵制。但是，基因治療作為一種全新的疾病治療方法，有著頑強(qiáng)的生命力，相關(guān)的研究一直十分活躍，并不斷取得可喜的成績。最早進(jìn)行基因治療研究的疾病是單基因遺傳病，這同時(shí)也是基因治療應(yīng)用最為成功的疾病之一。隨后，基因治療研究逐步擴(kuò)展到嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤、心血管疾病、病毒感染及代謝類疾病等，其中，腫瘤以及艾滋病等病毒性疾病的基因治療研究成為目前研究的熱點(diǎn)。上述研究已經(jīng)出臺(tái)了一批在體外實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有顯著療效的治療方案，其中許多方案有望在臨床上獲準(zhǔn)實(shí)施。通過以上講解，我們對(duì)基因治療有了一定的了解，目前比較熱點(diǎn)的的癌癥方式正是用基因治療的方法。（一）癌癥的定義癌癥（cancer），醫(yī)學(xué)術(shù)語亦稱惡性腫瘤（malignant neoplasm），中醫(yī)學(xué)中稱巖，由各種致癌物質(zhì)、致癌因素的作用下導(dǎo)致身體正常細(xì)胞發(fā)生癌變的結(jié)果。癌細(xì)胞的特點(diǎn)是：無限
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