【文章內(nèi)容簡介】 突變株。夾層培養(yǎng)法及結(jié)果限量補(bǔ)充培養(yǎng)法 把誘變處理后的細(xì)胞接種在含有微量（＜%）蛋白胨的基本培養(yǎng)基平板上，野生型細(xì)胞就迅速長成較大的菌落，而營養(yǎng)缺陷型則緩慢生長成小菌落。若需獲得某一特定營養(yǎng)缺陷型，可再在基本培養(yǎng)基中加入微量的相應(yīng)物質(zhì)。逐個檢出法 把經(jīng)誘變處理的細(xì)胞群涂布在完全培養(yǎng)基的瓊脂平板上，待長成單個菌落后，用接種針或滅過菌的牙簽把這些單個菌落逐個整齊地分別接種到基本培養(yǎng)基平板和另一完全培養(yǎng)基平板上，使兩個平板上的菌落位置嚴(yán)格對應(yīng)。經(jīng)培養(yǎng)后，如果在完全培養(yǎng)基平板的某一部位上長出菌落，而在基本培養(yǎng)基的相應(yīng)位置上卻不長，說明此乃營養(yǎng)缺陷型。影印平板法 將誘變劑處理后的細(xì)胞群涂布在一完全培養(yǎng)基平板上，經(jīng)培養(yǎng)長出許多菌落。用特殊工具——“印章”把此平板上的全部菌落轉(zhuǎn)印到另一基本培養(yǎng)基平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，比較前后兩個平板上長出的菌落。如果發(fā)現(xiàn)在前一培養(yǎng)基平板上的某一部位長有菌落，而在后一平板上的相應(yīng)部位卻呈空白，說明這就是一個營養(yǎng)缺陷型突變株。第四步，鑒定缺陷型：生長譜法。概念：生長譜法是指在混有供試菌的平板表面點(diǎn)加微量營養(yǎng)物，視某營養(yǎng)物的周圍有否長菌來確定該供試菌的營養(yǎng)要求的一種快速、直觀的方法。操作：把生長在完全培養(yǎng)液里的營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞經(jīng)離心和無菌水清洗后，配成適當(dāng)濃度的懸液（如107～108個／ml），傾注在培養(yǎng)皿內(nèi)，待凝固、表面干燥后，在皿背劃幾個區(qū)，然后在平板上按區(qū)加上微量待鑒定缺陷型所需的營養(yǎng)物粉末（用濾紙片法也可），例如氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶堿基等。經(jīng)培養(yǎng)后，如發(fā)現(xiàn)某一營養(yǎng)物的周圍有生長圈，就說明此菌就是該營養(yǎng)物的缺陷型突變株。用類似方法還可測定雙重或多重營養(yǎng)缺陷型。★第四節(jié) 基因重組和雜交育種概念：基因重組是指兩個獨(dú)立基因組內(nèi)的遺傳基因，通過一定的途徑轉(zhuǎn)移到一起，形成新的穩(wěn)定基因組的過程。一、原核微生物的基因重組主要有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和原生質(zhì)體融合4種形式。（一）轉(zhuǎn)化概念：受體菌直接吸收來自供體菌的DNA片段，通過交換將其整合到自己的基因組中，從而獲得了供體菌部分遺傳性狀的現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)化。通過轉(zhuǎn)化方式而形成的雜種后代，稱為轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化因子指有轉(zhuǎn)化活性的外源DNA片段。它是供體菌釋放或人工提取的游離DNA片段。轉(zhuǎn)化因子需具備兩個條件：較高的相對分子質(zhì)量和同源性。能進(jìn)行轉(zhuǎn)化的細(xì)胞必須是感受態(tài)的。感受態(tài)：受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。轉(zhuǎn)化的具體過程（G+ 菌肺炎鏈球菌）：供體菌的雙鏈DNA片段與感受態(tài)受體菌的細(xì)胞表面的特定位點(diǎn)結(jié)合，其中一條鏈被核酸酶水解，另一條進(jìn)入細(xì)胞。來自供體的單鏈DNA片段在細(xì)胞內(nèi)與受體細(xì)胞核染色體組上的同源區(qū)段配對、重組，形成一小段雜合DNA區(qū)段。受體菌染色體組進(jìn)行復(fù)制，雜合區(qū)段分離成兩個，其中之一獲得了供體菌的轉(zhuǎn)化基因，形成轉(zhuǎn)化子，另一個未得獲轉(zhuǎn)化基因。（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)概念：通過缺陷噬菌體的媒介，把供體細(xì)胞的小片段DNA攜帶到受體細(xì)胞中，通過交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。由轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而獲得部分新遺傳性狀的重組細(xì)胞，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子。 (1952年) 首先在鼠傷寒沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。1. 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 概念：通過極少數(shù)完全缺陷噬菌體對供體菌基因組上任何小片段DNA進(jìn)行“誤包”，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，稱為普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。噬菌體侵入寄主細(xì)胞后，在裝配階段，誤將寄主細(xì)胞DNA的某一片段包裹進(jìn)去。這樣的噬菌體稱缺陷噬菌體。體內(nèi)僅含有供體DNA的缺陷噬菌體稱完全缺陷噬菌體。體內(nèi)同時含有供體DNA和噬菌體DNA的缺陷噬菌體稱為部分缺陷噬菌體。當(dāng)包裹有寄主DNA片段的噬菌體釋放后，再度感染新的寄主，其中的供體菌的DNA片段進(jìn)入受體菌，并通過基因重組使受體菌形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。2. 局限轉(zhuǎn)導(dǎo)概念：局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)指通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。最初于1954年在大腸桿菌 K12中發(fā)現(xiàn)。它只能轉(zhuǎn)導(dǎo)一種或少數(shù)幾種基因（一般為位于附著點(diǎn)兩側(cè)的基因）。（三）接合概念：供體菌通過性菌毛與受體菌直接接觸，把F質(zhì)?；蚱鋽y帶的不同長度的核基因組片段傳遞給后者，使后者獲得若干新遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為接合。通過接合而獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞稱為接合子。研究細(xì)菌接合的營養(yǎng)缺陷型法原理細(xì)胞的接合現(xiàn)象在大腸桿菌中研究得最清楚。F因子(即致育因子或性質(zhì)粒) ：決定大腸桿菌性別，是一種獨(dú)立于染色體外的小型的環(huán)狀DNA，一般呈超螺旋狀態(tài)，它具有自主的與染色體進(jìn)行同步復(fù)制和轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞中去的能力。在大腸桿菌中每個細(xì)胞含有約1～4個F因子。F因子既可脫離染色體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在，也可整合到染色體組上；它既可經(jīng)過接合作用而獲得，也可通過一些理化因素(如吖啶橙、絲裂霉素、利福平、溴化乙錠和加熱等)的處理而從細(xì)胞中消除。F＋菌株可以與不含F(xiàn)因子的F－菌株接合，從而使后者也成為F＋菌株，其過程大體可分兩個階段：首先是F＋菌株與F－菌株配對，并通過性菌毛接合；然后F因子雙鏈DNA的一條單鏈在一特定的位置斷開，通過性菌毛內(nèi)腔向F－菌株細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，并同時在兩個菌株細(xì)胞內(nèi)以一條DNA單鏈為模板，各自復(fù)制合成完整的F因子。有些大腸桿菌的F因子可與核染色體整合在一起，這種類型的菌株與F－菌株接合的重組頻率比F＋與F－菌株接合的重組頻率高幾百倍以上，因此，常將其稱為高頻重組(Hfr)菌株。Hfr與F－菌株接合時，染色體的一條單鏈可以在F因子處斷裂，并以F因子為末端向F－菌株胞內(nèi)轉(zhuǎn)移。由于轉(zhuǎn)移的過程中常發(fā)生染色體的斷裂，所以這種接合可以使F－菌株獲得部分供體基因，但很少使F－菌株獲得F因子。Hfr菌株中的F因子有時可由不正常的切割而帶有一小段核染色體基因的雜合F因子，通常稱為F′因子。當(dāng)帶有F′菌株與F－菌株接合后，可使F－菌株成為既有F因子又帶有部分供體菌基因的次生F′菌株。 F質(zhì)粒的4種存在方式及相互關(guān)系（四）原生質(zhì)體融合概念：通過人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過程，稱為原生質(zhì)體融合。由此法獲得的重組子，稱為融合子。主要操作步驟：先選擇兩株有特殊價值、并帶有選擇性遺傳標(biāo)記的細(xì)胞作為親本菌株置于等滲溶液中，用適當(dāng)?shù)拿摫诿福ㄈ缂?xì)菌和放線菌可用溶菌酶等處理，真菌可用蝸牛消化酶或其他相應(yīng)酶處理）去除細(xì)胞壁，再將形成的原生質(zhì)體（包括球狀體）進(jìn)行離心聚集，加入促融合劑PEG(聚乙二醇)或借電脈沖等因素促進(jìn)融合，然后用等滲溶液稀釋，再涂在能促使它再生細(xì)胞壁和進(jìn)行細(xì)胞分裂的基本培養(yǎng)基平板上。形成菌落后，再通過影印平板法，接種到各種選擇性培養(yǎng)基平板上，檢驗(yàn)它們是否為穩(wěn)定的融合子，最后再測定其有關(guān)生物學(xué)性狀或生產(chǎn)性能。原生質(zhì)體融合技術(shù)有許多優(yōu)越性：它打破了微生物的種屬界限，可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株間的基因重組；可使遺傳物質(zhì)傳遞更完整，可快速組合性狀，加速育種速度；可借助聚合劑同時將幾個親本的原生質(zhì)體隨機(jī)地融合在一起，獲得綜合幾個親本性狀的重組體。 原生質(zhì)體融合的操作示意圖二、真核微生物的基因重組重點(diǎn)介紹有性雜交和準(zhǔn)性雜交。（一）有性雜交概念：有性雜交一般指不同遺傳型的兩性細(xì)胞間發(fā)生的接合和隨之進(jìn)行的染色體重組，進(jìn)而產(chǎn)生新遺傳型后代的一種育種技術(shù)。凡能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌，原則上都可應(yīng)用與高等動、植物雜交育種相似的有性雜交方法進(jìn)行育種。以釀酒酵母為例：釀酒酵母一般都是以雙倍體的形式存在。將不同生產(chǎn)性狀的甲、乙兩個親本分別接種到產(chǎn)孢子培養(yǎng)基(醋酸鈉培養(yǎng)基等)斜面上，使其產(chǎn)生子囊，經(jīng)過減數(shù)分裂后，在每個子囊內(nèi)會形成4個子囊孢子(單倍體)。用蒸餾水洗下子囊，經(jīng)機(jī)械研磨法或蝸牛酶酶解法破壞子囊，再經(jīng)離心，然后用獲得的子囊孢子涂布平板，就可以得到單倍體菌落。把兩個親體的不同性別的單倍體細(xì)胞密集在一起就有更多機(jī)會出現(xiàn)雙倍體的雜交后代。它們的雙倍體細(xì)胞和單倍體細(xì)胞有很大不同，易于識別。有了各種雙倍體的雜交子代后，就可以進(jìn)一步從中篩選出優(yōu)良性狀的個體。生產(chǎn)實(shí)踐中利用有性雜交培育優(yōu)良品種的例子很多。例如：用于酒精發(fā)酵的酵母和用于面包發(fā)酵的酵母雖屬同一種釀酒酵母，但兩者是不同的菌株，表現(xiàn)在前者產(chǎn)酒精率高而對麥芽糖和葡萄糖的發(fā)酵力弱，后者則產(chǎn)酒精率低而對麥芽糖和葡萄糖的發(fā)酵力強(qiáng)。兩者通過雜交，就得到了既能生產(chǎn)酒精，又能將其殘余的菌體綜合利用作為面包廠和家用發(fā)面酵母的優(yōu)良菌種。（二）準(zhǔn)性雜交概念：是一種類似于有性生殖但比它更為原始的兩性生殖方式。它可使同一生物的兩個不同來源的體細(xì)胞經(jīng)融合后，不通過減數(shù)分裂而導(dǎo)致低頻率的基因重組。準(zhǔn)性生殖常見于某些真菌,尤其是半知菌類中。準(zhǔn)性雜交包括下列幾個階段：1. 菌絲聯(lián)結(jié)發(fā)生于一些形態(tài)上沒有區(qū)別，但在遺傳性上有差別的兩個同種不同菌株的體細(xì)胞(單倍體)間。發(fā)生菌絲聯(lián)結(jié)的頻率很低。2. 形成異核體兩個遺傳型有差異的體細(xì)胞經(jīng)菌絲聯(lián)結(jié)后，先發(fā)生質(zhì)配，使原有的兩個單倍體核集中到同一個細(xì)胞中，形成雙相異核體。異核體能獨(dú)立生活。3. 核融合異核體中的雙核在某種條件下，低頻率地產(chǎn)生雙倍體雜合子核的現(xiàn)象。某些理化因素如樟腦蒸氣、紫外線或高溫等的處理，可以提高核融合的頻率。4. 體細(xì)胞交換和單倍體化體細(xì)胞交換即體細(xì)胞中染色體間的交換，也稱有絲分裂交換。雙倍體雜合子性狀極不穩(wěn)定，在其進(jìn)行有絲分裂過程中，其中極少數(shù)核中的染色體會發(fā)生交換和單倍體化，從而形成了極個別具有新性狀的單倍體雜合子。如對雙倍體雜合子用紫外線、γ射線等進(jìn)行處理，就會促進(jìn)染色體斷裂、畸變或?qū)е氯旧w在兩個子細(xì)胞中分配不均，因而有可能產(chǎn)生各種不同性狀組合的單倍體雜合子。第五節(jié) 基因工程概念：基因工程又稱遺傳工程，是指人們利用分子生物學(xué)的理論和技術(shù)，自覺設(shè)計(jì)、操縱、改造和重建細(xì)胞的基因組，從而使生物體的遺傳性狀發(fā)生定向變異，以最大限度地滿足人類活動的需要。是一種自覺的、可人為操縱的體外DNA重組技術(shù)，是一種可達(dá)到超遠(yuǎn)緣雜交的育種技術(shù)，更是一種前景寬廣、正在迅速發(fā)展的定向育種新技術(shù)。一、基因工程的基本操作基因工程的基本操作包括：目的基因的取得，載體系統(tǒng)的選擇，目的基因與載體重組體的構(gòu)建，重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，“工程菌”或“工程細(xì)胞株”的表達(dá)、檢測以及實(shí)驗(yàn)室和一系列生產(chǎn)性試驗(yàn)等。（一）目的基因的取得選擇目的基因的途徑有3種：①選擇適宜的供體細(xì)胞，以便從中采集分離到有生產(chǎn)意義的目的基因；②通過逆轉(zhuǎn)錄酶的作用由mRNA合成cDNA(互補(bǔ)DNA)；③用化學(xué)方法合成特定功能的基因。（二）選擇載體載體必須具備下列幾個條件：①是一個有自我復(fù)制能力的復(fù)制子；②能在受體細(xì)胞內(nèi)大量增殖，有較高的復(fù)制率；③載體上最好只有一個限制性內(nèi)切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到載體DNA的一定