【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 （3）探針特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測(cè)。合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，在5端(和/或3端)進(jìn)行標(biāo)記，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化。純度應(yīng)達(dá)到HPLC純，應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明。（4）PCR反應(yīng)所需酶DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時(shí)后仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，應(yīng)對(duì)酶活性有合理驗(yàn)證；逆轉(zhuǎn)錄酶，具逆轉(zhuǎn)錄酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性。應(yīng)提供有關(guān)保存穩(wěn)定性、活性及功能實(shí)驗(yàn)等的驗(yàn)證資料。3．對(duì)照品（質(zhì)控品）的原料選擇、制備、定值過程及試驗(yàn)資料。4．核酸類檢測(cè)試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無DNase和RNase污染。（六）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料基本生產(chǎn)工藝主要包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對(duì)pH、電導(dǎo)率等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制。生產(chǎn)工藝研究資料應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如臨床樣本類型、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì)控體系設(shè)置、Ct(臨界)值確定等，提供確切的依據(jù)，主要包括以下內(nèi)容：，可以圖表方式表示。、RTPCR方法學(xué)特性介紹。RTPCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度等。RTPCR反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間及循環(huán)數(shù)的研究資料。6．對(duì)于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確定的研究資料。另外，對(duì)于試劑盒的對(duì)照（質(zhì)控）品設(shè)置，建議企業(yè)參考以下要求執(zhí)行：（1）流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒的外部對(duì)照（質(zhì)控）品應(yīng)至少設(shè)置臨界陽性對(duì)照（質(zhì)控）品和陰性對(duì)照（質(zhì)控）品，均應(yīng)參與樣本核酸的平行提取，以對(duì)核酸提取、RTPCR反應(yīng)過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。企業(yè)應(yīng)對(duì)各種對(duì)照（質(zhì)控）品的Ct值做出明確的范圍要求。注意，建議采用與實(shí)際檢測(cè)樣本具有相同或相似性狀的基質(zhì)溶液作為陰性對(duì)照（質(zhì)控）品，不推薦采用水作為陰性對(duì)照（質(zhì)控）品。（2）樣本反應(yīng)管應(yīng)設(shè)置合理的內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）以對(duì)管內(nèi)抑制可能造成的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)標(biāo)的引物、探針和模板的濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對(duì)靶基因檢測(cè)造成的競(jìng)爭(zhēng)性抑制而導(dǎo)致假陰性。對(duì)內(nèi)標(biāo)的Ct值也應(yīng)有明確的范圍要求。（3）關(guān)于對(duì)照品的原料選擇：內(nèi)對(duì)照（內(nèi)標(biāo)）應(yīng)采用具有蛋白外殼的病毒顆粒，如滅活的流感病毒或缺陷病毒（假病毒），外部陽性對(duì)照可以采用滅活病毒、假病毒或質(zhì)粒。（七）分析性能評(píng)估資料企業(yè)應(yīng)提交原廠在產(chǎn)品研制階段對(duì)試劑盒進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，包括具體研究方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)方法等詳細(xì)資料。對(duì)于流感病毒核酸類定性檢測(cè)試劑，建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究。1.流感病毒核酸（RNA）提取病毒RNA提取主要有以下目的：富集靶核酸濃度、保證靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是決定RTPCR成敗的要素之一。RNA極易受RNA酶（RNase）的降解，而臨床標(biāo)本和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中存在大量的RNase，因此，無論申報(bào)產(chǎn)品是否含有RNA分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)對(duì)核酸提取的環(huán)節(jié)做詳細(xì)的驗(yàn)證。除最大量分離出目的RNA外，還應(yīng)有純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。傳統(tǒng)的RNA分離純化方法（如表面活性劑加蛋白酶結(jié)合氯仿酚抽提法）和改良方法（如硅磁性微粒吸附法）均有或多或少的優(yōu)勢(shì)和不足，申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合申報(bào)產(chǎn)品的特性，合理選擇RNA分離/純化試劑，并提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。最低檢測(cè)限（分析靈敏度）（1）最低檢測(cè)限的確定建議使用培養(yǎng)后病毒原液的梯度稀釋液進(jìn)行最低檢測(cè)限確定，每個(gè)梯度的病毒稀釋液重復(fù)35份，將具有90%95%陽性檢出率的病毒水平作為最低檢測(cè)限。通過另制備至少5份最低檢測(cè)限濃度水平的病毒稀釋液對(duì)90%95%的檢出率進(jìn)行確認(rèn)。建議采用半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(50%tissuecultureinfectiousdose，TCID50）或空斑形成單位（plaqueformingunits，PFU）法進(jìn)行病毒滴度的滴定，并采用上述兩種方式作為病毒濃度的表示方式。在進(jìn)行最低檢測(cè)限的確認(rèn)時(shí)，參與研究的甲型流感病毒各亞型和乙型流感病毒應(yīng)至少包括不同來源的兩個(gè)具有代表性的病毒株的系列稀釋梯度。（2）最低檢測(cè)限的驗(yàn)證申報(bào)試劑應(yīng)在最低檢測(cè)限或接近最低檢測(cè)限的病毒濃度對(duì)每種待測(cè)流感病毒亞型具有時(shí)間和區(qū)域特征性的至少3個(gè)病毒株進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)此，企業(yè)應(yīng)能夠提供用于最低檢出限驗(yàn)證的各個(gè)病毒株的來源、型別確認(rèn)及滴度確認(rèn)試驗(yàn)等信息。用于最低檢測(cè)限確定和驗(yàn)證的病毒株如包括疫苗株，則其應(yīng)能夠體現(xiàn)最近流感發(fā)病季的病毒特點(diǎn)。分析特異性（1）交叉反應(yīng)①用于流感病毒核酸檢測(cè)試劑交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他微生物。②建議在病毒和細(xì)菌感染的的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的水平為106cfu/ml或更高，病毒為105pfu/ml或更高。③首先，應(yīng)在流感病毒不同型別和亞型間進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證；其次，采用其它的病原微生物進(jìn)行驗(yàn)證（見表1）。④申請(qǐng)人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗(yàn)微生物類型腺病毒1型腺病毒7型人冠狀病毒*巨細(xì)胞病毒腸道病毒人副流感病毒3型麻疹病毒人偏肺病毒流行性腮腺炎病毒呼吸道合胞病毒B型鼻病毒1A型百日咳桿菌肺炎衣原體棒狀桿菌＊大腸桿菌＊流感嗜血桿菌乳桿菌＊卡他莫拉菌＊無毒結(jié)核分枝桿菌肺炎支原體腦膜炎奈瑟菌淋球菌＊銅綠假單胞菌＊金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌＊肺炎鏈球菌化膿鏈球菌唾液鏈球菌證的信息應(yīng)以列表的方式在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中有所體現(xiàn)。表1 用于交叉反應(yīng)研究的微生物（推薦）＊項(xiàng)：選擇性驗(yàn)證（2）干擾物質(zhì)物質(zhì)活性成分粘蛋白純化粘蛋白人血液鼻腔噴霧劑或滴鼻劑腎上腺素、羥甲唑啉、含防腐劑的氯化鈉溶液鼻腔糖皮質(zhì)激素倍氯米松、地塞米松、氟尼縮松、曲安西龍、布地奈德、莫美他松、氟替卡松鼻用凝膠硫磺過敏性癥狀緩解藥物金英潤喉片、口服麻醉劑和鎮(zhèn)痛劑苯唑卡因、薄荷腦抗病毒藥物扎那米韋抗生素、鼻用軟膏莫匹羅星全身抗