[工學(xué)]細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)總結(jié)(編輯修改稿)
2025-04-19 01:34 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 何從組織分離細(xì)胞?收集到的細(xì)胞懸液經(jīng)100目過(guò)濾篩過(guò)濾，1200轉(zhuǎn)離心5 min；離心管用酒精擦拭后拿進(jìn)超凈臺(tái)，擰開(kāi)蓋子后，管口過(guò)火焰兩次，倒出上清，保存管口向下蘸一下干的酒精棉球，再保存管口向下過(guò)火焰兩次；細(xì)胞沉淀用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液重新懸浮；繪圖展示自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果、談?wù)勀愕膶?shí)驗(yàn)感想。實(shí)驗(yàn)三：培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察及活率檢測(cè)1簡(jiǎn)述培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察方法及注意事項(xiàng)。 (一)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察將細(xì)胞培養(yǎng)瓶從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，注意觀察細(xì)胞培養(yǎng)液的顏色和清澈度。然后，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶平穩(wěn)地放在倒置顯微鏡載物臺(tái)上，此時(shí)應(yīng)注意不要將瓶翻轉(zhuǎn)，也不要讓瓶?jī)?nèi)的液體接觸瓶塞或流出瓶口。打開(kāi)倒置鏡光源，通過(guò)雙筒目鏡將視野調(diào)到合適的亮度。調(diào)節(jié)載物臺(tái)的高度進(jìn)行對(duì)焦，在看到細(xì)胞層之后，再用細(xì)調(diào)節(jié)器將物像調(diào)清楚，注意觀察細(xì)胞的輪廓、形狀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。在觀察時(shí)，最經(jīng)常使用的是20X物鏡（繪圖）。 (二) 觀察細(xì)胞體外培養(yǎng)狀況細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可進(jìn)行觀察，觀察的重點(diǎn)如下：A．首先要觀察培養(yǎng)細(xì)胞是否污染（觀察陽(yáng)性對(duì)照樣品）。主要觀察培養(yǎng)液顏色的變化及混濁度。B．觀察培養(yǎng)基顏色變化及細(xì)胞是否生長(zhǎng)。C．如細(xì)胞已生長(zhǎng)，則要觀察細(xì)胞的形態(tài)特征并判斷其所處的生長(zhǎng)階段。D．觀察完畢，可用臺(tái)盼藍(lán)染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。以確定死、活細(xì)胞的比例。簡(jiǎn)述臺(tái)盼蘭染色和伊紅染色檢測(cè)細(xì)胞活率的原理及操作方法。臺(tái)盼蘭染色原理：由于培養(yǎng)基內(nèi)有pH指示劑的存在，因此它的顏色往往可以間接地表明細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。呈橙黃色時(shí)，細(xì)胞一般生長(zhǎng)狀態(tài)較好；呈淡黃色時(shí)，則可能是培養(yǎng)時(shí)問(wèn)過(guò)長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)不足，死亡細(xì)胞過(guò)多；如呈紫紅色，則可能是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好，或已死亡。實(shí)際上，一種細(xì)胞在培養(yǎng)中的形態(tài)并不是永恒不變的，它隨營(yíng)養(yǎng)、pH、生長(zhǎng)周期而改變，但在比較穩(wěn)定的條件下形態(tài)基本是一致的。在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)中，鏡下折光率高，圓而發(fā)亮的一般被認(rèn)為是分裂期細(xì)胞。伊紅染色檢測(cè)細(xì)胞活率的原理：貼壁細(xì)胞在生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，看不到有空泡，細(xì)胞邊緣清楚，培養(yǎng)基內(nèi)看不到懸浮的細(xì)胞和碎片，培養(yǎng)液清澈透明，而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)顆粒較多，透明差，空泡多時(shí)，表明生長(zhǎng)較差。當(dāng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基混濁時(shí)，應(yīng)想到細(xì)菌真菌污染的可能。操作方法：（四）臺(tái)盼蘭染色1）％(W/V)臺(tái)盼蘭水溶液（溶于PBS，加熱使之完全溶解，用濾紙或紗布過(guò)濾除渣，裝入瓶?jī)?nèi)室溫保存）， %(W/V) Nacl溶液；2）測(cè)定前，％臺(tái)盼蘭與1份鹽水混合；3）取臺(tái)盼蘭溶液，另入到等量細(xì)胞懸中(細(xì)胞濃度25106細(xì)胞/mL)混勻；4）將細(xì)胞懸液加入血球計(jì)數(shù)板中，使液體自然充滿計(jì)數(shù)板小室。注意不要使小室內(nèi)有氣泡產(chǎn)生，否則要重新滴加。分別計(jì)數(shù)末染色的細(xì)胞數(shù)(活細(xì)胞)及染色的(死細(xì)胞)細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)200個(gè)以上，（繪圖）。5）計(jì)算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）100 %。（五）伊紅Y染色1）％(W/V，溶于PBS)伊紅Y水溶液；2）(細(xì)胞濃度25106細(xì)胞/mL)，加入等量伊紅Y溶液混勻；3）2 min后將細(xì)胞懸液加入血球計(jì)數(shù)板中，鏡檢、計(jì)數(shù)。死細(xì)胞染成桃紅色，活細(xì)胞不著色（繪圖）。細(xì)胞計(jì)數(shù)200個(gè)以上。，（繪圖）4）計(jì)算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）100％。繪圖展示自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果、談?wù)勀愕膶?shí)驗(yàn)感想。放大的計(jì)數(shù)室 按下式進(jìn)行細(xì)胞濃度的計(jì)數(shù)： 注① 。1mL=l，0000大格，因此，1大格細(xì)胞數(shù)104=細(xì)胞數(shù)／mL。注② 染色標(biāo)本在1
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