細(xì)胞生物反應(yīng)器制藥(編輯修改稿)
2025-02-14 02:29 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ES進(jìn)行克隆，可培育轉(zhuǎn)基因個(gè)體。在小鼠上應(yīng)用成熟，大動(dòng)物較晚。從豬胚胎中獲得了干細(xì)胞克隆系1988，牛的胚胎干細(xì)胞 1990。建立大家畜 ES細(xì)胞系仍很困難，但隨著一些相關(guān)關(guān)鍵技術(shù)的成熟，ES細(xì)胞介導(dǎo)法將會在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究中起到更加重要的作用 精子載體法 直接用精子作為外源 DNA載體的基因轉(zhuǎn)移方法。精子直接與外源 DNA混合培養(yǎng)，外源基因可以進(jìn)入精子頭部，受精后能發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其整合率低（雞為 %），但表達(dá)率高達(dá) 50%。 許多因素影響 DNA與精子結(jié)合。較長的 DNA片段比較短的 DNA片段（ 150～ 750dp）更容易被精子所攝取。對精子和附睪精子的清洗可提高精子與 DNA的結(jié)合率。目前已采用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法，脂質(zhì)體借靜電作用吸附于細(xì)胞表面，通過與細(xì)胞膜融合，細(xì)胞內(nèi)吞而將結(jié)合的基因?qū)爰?xì)胞。 受精前卵細(xì)胞顯微注射法 Anthony等（ 1999）嘗試一種新方法：預(yù)先將小鼠精子進(jìn)行破膜處理，與編碼綠色熒光蛋白 GFP報(bào)告分子的外源 DNA短時(shí)間（ 1min）共孵育，然后徽注射入減數(shù)分裂 II期的卵母細(xì)胞質(zhì)中，取得 64%～ 94%轉(zhuǎn)基因表達(dá)胚胎。將轉(zhuǎn) GFP的胚胎移植， 20%的后代表現(xiàn)為基因整合。 此項(xiàng)研究揭示，精子膜經(jīng)冷凍干燥或解凍處理后，外源 DNA可穿過外膜，吸附于內(nèi)膜。因此外源 DNA能通過精子的徽注射有效轉(zhuǎn)入卵母細(xì)胞，經(jīng)膜處理的攜外源 DNA精子的徽注射是一種有效的轉(zhuǎn)基因手段。 2022/2/13 細(xì)胞工程 22 四種方法比較 方法 顯微注射 胚胎干細(xì)胞 逆轉(zhuǎn)錄病毒 精子介導(dǎo) 優(yōu)點(diǎn) 外源基因整合效率較高，不需要載體，目的基因的長度可達(dá) 100Kb 外源 DNA的整合率高； 整合在生殖細(xì)胞中的比例也很高。 可在整合點(diǎn)整合轉(zhuǎn)移基因的單個(gè)拷貝； 該方法簡單、方便 缺點(diǎn) 精密儀器， 技術(shù)操作較難，易造成宿主動(dòng)物基因組的插入突變 ES細(xì)胞株不易建立，長期培養(yǎng)后出現(xiàn)分化現(xiàn)象；生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物都是嵌合體 插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源 DNA 在動(dòng)物各種組織中的分布不均 有些結(jié)果不能重復(fù) 酵母人工染色體 (YAC)載體是近年發(fā)展起來的新型載體 , 它能克隆百萬對堿基的大片段 DNA。 作為制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物載體具有以下 優(yōu)點(diǎn)： A. 保證大片段 DNA的完整性 B. 提高較長外源片段在動(dòng)物轉(zhuǎn)基因時(shí)的整合率 C. 保證目的基因上下游的側(cè)翼序列的完整性，因而可以消除或減弱基因整合后的位置效應(yīng) .因此， YAC介導(dǎo)法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有廣闊的應(yīng)用前景 酵母人工染色體 (YAC)法 一般把目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物叫動(dòng)物生物反應(yīng)器 （ bioreactor）， 幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過人為馴化為生物反應(yīng)器 ,從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器 ,動(dòng)物血液生物反應(yīng)器和動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器等。其中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物
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