【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 物的分離成為可能，大大拓寬了 CE 的應(yīng)用范圍。 1985 年， Hjerten[18]首次引入了毛細(xì)管等電聚焦（ CIEF）的概念。 1987 年， Karger[19]改進(jìn)了凝膠填充技術(shù)，提高了 CGE 的分離效率。 1988 年以后， HPCE 商品儀器的問(wèn)世及高靈敏度柱上檢測(cè)器的發(fā)展，使高效毛細(xì)管研究在世界范圍內(nèi)蓬勃開(kāi)展，促進(jìn)了 HPCE 技術(shù)和理論的迅猛發(fā)展。 1991年 ， Jenson 和 Monnig 首次提出了高速毛細(xì)管電泳 (highspeed capillary electrophoresis 或 fast capillary electrophoresis,HSCE 或 fastCE)技術(shù) ,即采用細(xì)內(nèi)徑和較短的毛細(xì)管來(lái)實(shí)現(xiàn)高速分離。自此以后 ， CE 的研究成為分析化學(xué)領(lǐng)域的熱門(mén)課題 ， 6 人們競(jìng)相展開(kāi)了對(duì)毛細(xì)管電泳理論、儀器、柱技術(shù)、與其他分析手段聯(lián)用技術(shù)及在生命科學(xué)醫(yī)藥食品應(yīng)用上的全面研究。 ⑴ 毛細(xì)管電泳法的裝置 毛細(xì)管電 泳系統(tǒng) 的基本結(jié)構(gòu) [20,21]:高壓電源； 毛細(xì)管； 緩沖液池； 檢測(cè)器； 加樣系統(tǒng)。 圖 1 毛細(xì)管電泳裝置示意圖 Figure 1 capillary electrophoresis schematic diagram 進(jìn)樣壓力 ： 虹吸進(jìn)樣 進(jìn)樣方式 ： 正極進(jìn)樣 ， 負(fù)極檢測(cè)。 進(jìn)樣高度差 ： 10 cm。 ⑵ 毛細(xì)管電泳法的原理 毛細(xì)管電泳的基本原理是基于離子或者荷電子在一定 pH 的自由溶液中以電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力 ， 在毛細(xì)管中按照電泳淌度的不同進(jìn)行分離的一種模式 [22]。在毛細(xì)管電泳中有兩種基本策略可以 實(shí)現(xiàn)手性分離，一是構(gòu)建手性分離環(huán)境，二是手性消除。由于手性消除反應(yīng)需要昂貴的手性反應(yīng)試劑，而且產(chǎn)物的手性可能不得恢復(fù)，所以多數(shù)人不愿意采取這種方法，轉(zhuǎn)而采用構(gòu)建手性環(huán)境的方法。手性環(huán)境可以通過(guò)三種方法來(lái)構(gòu)建：1. 使用手性添加劑。 2. 使用手性添加毛細(xì)管。 3. 使用手性涂層毛細(xì)管。其中除毛細(xì)管等點(diǎn)聚焦外，其他分離模式都可以用于手性分離 [23]，是較為有效的手性拆分技術(shù)。 7 ⑶ 毛細(xì)管電泳法的分離模式 目前， 根據(jù)分離機(jī)理不同， 毛細(xì)管電泳 大致 分 為 有以下幾種 模式 [24] ： 1. 毛細(xì)管區(qū)帶電泳 (capillary zone electrophoresis,CZE)，又稱(chēng)毛細(xì)管自由電泳，用以分析帶電溶質(zhì)。為了降低電滲流和吸附現(xiàn)象，可將毛細(xì)管內(nèi)壁涂層。 它 是毛細(xì)管電泳中最基本、應(yīng)用最普遍的一種模式。前述基本原理即是毛細(xì)管區(qū)帶電泳的基本原理。迄今為止 CZE 仍是應(yīng)用最多的模式。 2. 毛細(xì)管凝膠電泳 (capillary gel electrophoresis,CGE)。在毛細(xì)管中裝入單體，引發(fā)聚合形成凝膠，主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)、 DNA 等大分子化合物。另有將聚合物溶液等具有篩分作用的物質(zhì)，如葡聚糖、聚環(huán)氧乙烷，裝入毛細(xì)管中進(jìn) 行分析，稱(chēng)毛細(xì)管無(wú)膠篩分電泳，故有時(shí)將此種模式總稱(chēng)為毛細(xì)管篩分電泳 [25] ，下分為凝膠和無(wú)膠篩分兩類(lèi)。 3. 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜 (micellar electrokiic capillary chromatography, MECC)。在緩沖液中加入離子型表面活性劑如十二烷基硫酸鈉，形成膠束，被分離物質(zhì)在水相和膠束相（準(zhǔn)固定相）之間發(fā)生分配并隨電滲流在毛細(xì)管內(nèi)遷移，達(dá)到分離。本模式能用于中性物質(zhì)的分離。 4. 毛細(xì)管電色譜 (capillary electrochromatogryphy, CEC)。 它 是將高效液相色譜的固定相填充到毛細(xì)管中或在毛細(xì)管內(nèi)壁涂布固定相，以電滲流為流動(dòng)相驅(qū)動(dòng)力的色譜過(guò)程，此模式兼具電泳和液相色譜 [26]的分離機(jī)制。 5. 毛細(xì)管等電聚焦電泳 (capillary isoelectric focusing, CIEF)。 它 是通過(guò)內(nèi)壁涂層使電滲流減到最小，再將樣品和兩性電解質(zhì)混合進(jìn)樣，兩個(gè)電極槽中分別為酸和堿，加高電壓后，在毛細(xì)管內(nèi)建立了 pH 梯度，溶質(zhì)在毛細(xì)管中遷移至各自的等電點(diǎn)，形成明顯區(qū)帶，聚焦后用壓力或改變檢測(cè)器末端電極槽儲(chǔ)液的 pH 使溶質(zhì)通過(guò)檢測(cè)器。 6. 毛細(xì)管等速電泳 (capillary esotachophoresis, CITP)。采用先導(dǎo)電解質(zhì)和后繼電解質(zhì)，使溶質(zhì)按其電泳淌度不同得以分離。 以上各模式以 1 、 2 、 3 種應(yīng)用較多。 此外，還有在這些 CE 基本分離模式基礎(chǔ)上利用各種技術(shù)建立起來(lái)的特殊的分離模式，如親和毛細(xì)管電泳 (利用生物分子或其他受體分子與其相應(yīng)的專(zhuān)一分子可逆親和特性來(lái)進(jìn)行電泳分離 )，毛細(xì)管矩陣電泳 [27](大量毛細(xì)管平行分離 )微毛細(xì)管電泳 [28] (將微系統(tǒng)技術(shù)應(yīng)用于 CE，把化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物引入毛細(xì)管進(jìn)行電泳分離 )等。 8 ⑷ 毛細(xì)管電泳法的特點(diǎn) 毛細(xì)管電泳除 了比其它色譜分離分析方法具有效率更高、速度更快、樣品和試劑耗量更少、應(yīng)用面同樣廣泛等優(yōu)點(diǎn)外 [29]，其儀器結(jié)構(gòu)也比高效液相色譜簡(jiǎn)單。毛細(xì)管電泳只需高壓直流電源、進(jìn)樣裝置、毛細(xì)管和檢測(cè)器。前三個(gè)部件均易實(shí)現(xiàn)，困難之處在于檢測(cè)器，特別是光學(xué)類(lèi)檢測(cè)器。由于毛細(xì)管電泳溶質(zhì)區(qū)帶的超小體積的特性導(dǎo)致光程太短，而且圓柱形毛細(xì)管作為光學(xué)表面也不夠理想，因此對(duì)檢測(cè)器靈敏度要求相當(dāng)高 [30]。 ⑸ 毛細(xì)管電泳發(fā)在藥物分析中的應(yīng)用前景 盡管毛細(xì)管電色譜 (CEC)技術(shù)的發(fā)展歷史并不長(zhǎng) ,但作為一個(gè)新興的分離分析技術(shù) ,其研究和發(fā)展的生 命力最終必將體現(xiàn)在解決一些實(shí)際樣品分離分析時(shí)所具有的優(yōu)越性 ,因此 ,CEC技術(shù)發(fā)展到一定的階段后必定會(huì)伴隨著大量的實(shí)際應(yīng)用 ,其結(jié)果又將促進(jìn) CEC 技術(shù)的研究和開(kāi)發(fā)。本文將從已有的大量文獻(xiàn)報(bào)道中篩選出一些比較有代表性的應(yīng)用實(shí)例進(jìn)行介紹。 高效毛細(xì)管電泳 （ HPCE） 已應(yīng)用到分析、分離的各個(gè)方面，且具有高靈敏度、高速、樣品耗用量少、重現(xiàn)性好、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，隨著商品化儀器的不斷改進(jìn)，必將在分析領(lǐng)域得到更為廣泛的應(yīng)用。 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法也稱(chēng)外標(biāo)法或直接比較法，是一種簡(jiǎn)便、快速的定量方法。具體方法是：用標(biāo)準(zhǔn)樣 品配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，在與待測(cè)組分相同的色譜條件下，等體積準(zhǔn)確進(jìn)樣，測(cè)量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對(duì)樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，此標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)應(yīng)是通過(guò)原點(diǎn)的直線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率即為絕對(duì)校正因子。 在測(cè)定樣品中的組分含量時(shí)，要用與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)完全相同的色譜條件作出色譜圖，測(cè)量色譜峰面積或峰高，然后根據(jù)峰面積和峰高在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上直接查出注入色譜柱中樣品組分的濃度。 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法的優(yōu)點(diǎn)是：繪制好標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)后測(cè)定工作就變得相當(dāng)簡(jiǎn)單，可直接從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)上讀出含量，因此特別適合于大量樣品的分析。 9 重結(jié)晶提純 固體方法 重結(jié)晶提純法 [31]是有機(jī)反應(yīng)分離固體粗產(chǎn)物的最常用的方法之一，其原理是利用混合物中各組分在某種溶劑中的溶解度不同，或在同一溶劑中不同溫度時(shí)的溶解度不同，而使它們分離開(kāi)來(lái)。重結(jié)晶提純法的一般過(guò)程： ① 選擇溶劑； ② 溶解固體； ③ 除去雜質(zhì)； ④ 晶體析出； ⑤ 晶體的收集與洗滌； ⑥ 晶體的干燥 [32]。其中，除去雜質(zhì)步驟是重結(jié)晶操作關(guān)鍵步驟之一，主要采用趁熱過(guò)濾的方法除去不溶性雜質(zhì)，活性炭吸附有色或某些樹(shù)脂狀、懸浮狀顆粒。趁熱過(guò)濾是重結(jié)晶操作成功與否的關(guān)鍵，如果操作不當(dāng)，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品的大量損失。傳統(tǒng)的趁熱過(guò)濾操作是采 用熱水漏斗過(guò)濾，理論上說(shuō)熱水漏斗在能起到保溫作用，使漏斗內(nèi)濾紙上溶液的溫度基本保持不變。但實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，用熱水漏斗過(guò)濾的方法很難保持過(guò)濾溶液的溫度，特別是在環(huán)境溫度不高的情況下，溶液受環(huán)境溫度的影響非常大，溶液溫度下降很快，在濾紙上很快就有大量的晶體析出。 本課題的研究目的與意義 以 撲熱息痛 為研究對(duì)象， 以 毛細(xì)管電泳法 [33~35]為實(shí)驗(yàn)手段， 用方法學(xué)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，找出檢測(cè)限、定量限、 線(xiàn)性范圍，檢驗(yàn) 其穩(wěn)定性、精密度。同時(shí) 測(cè)定不同樣品中撲熱息痛 的含量。 并與紫外分光光度法、高效液相色譜法 [36~40]進(jìn)行 比較。 10 二 實(shí)驗(yàn)部分 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 撲熱息痛的提純 稱(chēng)取粗 撲熱息痛少量 ，置于 250 mL 燒杯中 ，加入適量純水，加熱至沸騰，直至撲熱息痛 溶解，若不溶解，可適量添加少量熱水，攪拌并熱至接近沸騰使 撲熱息痛 溶解，稍冷后，加入適量活性炭于溶液中，煮沸 5~10 min，趁熱用放有折疊式濾紙的熱水漏斗過(guò)濾，用一 錐形瓶 收集濾液。 在過(guò)濾過(guò)程中，熱水漏斗和溶液均用小火加熱保溫以免冷卻。濾液放置冷卻后，有 撲熱息痛 晶體析出，抽氣過(guò)濾，用玻璃釘或玻璃瓶塞壓擠晶體，繼續(xù)抽濾，盡量除去母液，然后進(jìn)行晶體的洗滌工作。取出晶體，放在表面皿上晾干，稱(chēng)重 [41]。 HV30I 高壓電源 北京彩陸科學(xué)儀器有限公司 UVK2501 型紫外檢測(cè)器 北京彩陸科學(xué)儀器有限公司 CL1030 高效毛細(xì)管電泳儀 北京彩陸科學(xué)儀器有限公司 UV1201 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器有限公司 pHS25 型 pH 計(jì) 上海精科雷磁公司 DL180 型超聲波清洗機(jī) 浙江省象山縣石油海天電子儀器廠(chǎng) BS210 S 型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司 二次蒸餾水 實(shí)驗(yàn)室自制 熔 融石英毛細(xì)管 （ 50 ?m .） 河北永年銳灃色譜器件有限公司 XT4A 顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀（控溫型） 北京市科儀電光儀器廠(chǎng) 氫氧化鈉（分析純） 沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠(chǎng) 硼砂（ 分析 純） 開(kāi)源化學(xué)試劑廠(chǎng) 撲熱息痛 實(shí)驗(yàn)室自制 11 用 XT4A 顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀（控溫型） 測(cè) 其熔點(diǎn) 是 172 ℃，即為撲熱息痛標(biāo)準(zhǔn)品。 實(shí)驗(yàn)條件 波長(zhǎng)的選擇 將 撲熱息痛的標(biāo)準(zhǔn)品 溶于二次蒸餾水制成約 10 ug/mL 的溶液，在 200~400 nm 范圍內(nèi)紫外掃描，其紫外掃描圖見(jiàn)圖 1。撲熱息痛在 243 nm 處有最大吸收，故選擇 243 nm 為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。 圖 2 撲熱息痛在 200~400nm 范圍內(nèi)的紫外掃描圖 Figure 2 ultraviolet scan of paracetamol in 200 ~ 400 nm range 電泳條件 實(shí)驗(yàn)考察了硼砂、硼砂 氫氧化鈉 、磷酸二氫鈉－硼砂 等作背景電解質(zhì)，結(jié)果表明 50 mol/L 硼砂為 背景電解質(zhì) 時(shí)，撲熱息痛樣品峰型最好 ，基線(xiàn)噪音最小 ；實(shí)驗(yàn)繼續(xù)考察了背景電解質(zhì)溶液 pH 為 ~ 時(shí) 撲熱息痛 樣品出峰情況，得出最佳 pH ，此時(shí)基線(xiàn)較穩(wěn)， 信噪比較高且穩(wěn)定 ，而且峰型也 最好；同時(shí)實(shí)驗(yàn)考察了 分離電壓在10~20kV 范圍內(nèi)，撲熱息痛出峰情況，最終選擇分離電壓 15kV，在此條件下，撲熱息痛樣品 10 min 內(nèi)出峰。 由此得出最佳電泳條件： 12 背景電解質(zhì)溶液： 精密稱(chēng)取 g 硼 砂 適量溶于蒸餾水中， 用 10%磷酸和 M 氫氧化鈉調(diào)至 pH=。 操作條件：背景電解質(zhì)和樣品溶液均經(jīng) mm 微孔濾膜過(guò)濾，并超聲脫氣。 毛細(xì)管：總長(zhǎng) 50 cm，有效長(zhǎng)度 45 cm，內(nèi)徑 50 mm。 洗柱方式 ：毛細(xì)管柱依次用 mol/L 氫氧化鈉液 、二次蒸餾水、 背景電解質(zhì)溶液各沖洗 10 min 后進(jìn)樣；進(jìn)樣間用二次蒸餾水、 背景電解質(zhì) 溶液各沖洗 5 min 后進(jìn)行下次進(jìn)樣。 進(jìn)樣方式：采用虹吸進(jìn)樣，進(jìn)樣高度差 10 cm，進(jìn)樣時(shí)間 10 s，正極進(jìn)樣負(fù)極檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng) 243 nm。 進(jìn)樣溫度 ：室 溫（ 20 ℃ ）。