【文章內容簡介】 物的分離成為可能，大大拓寬了 CE 的應用范圍。 1985 年， Hjerten[18]首次引入了毛細管等電聚焦（ CIEF）的概念。 1987 年， Karger[19]改進了凝膠填充技術，提高了 CGE 的分離效率。 1988 年以后， HPCE 商品儀器的問世及高靈敏度柱上檢測器的發(fā)展，使高效毛細管研究在世界范圍內蓬勃開展，促進了 HPCE 技術和理論的迅猛發(fā)展。 1991年 ， Jenson 和 Monnig 首次提出了高速毛細管電泳 (highspeed capillary electrophoresis 或 fast capillary electrophoresis,HSCE 或 fastCE)技術 ,即采用細內徑和較短的毛細管來實現(xiàn)高速分離。自此以后 ， CE 的研究成為分析化學領域的熱門課題 ， 6 人們競相展開了對毛細管電泳理論、儀器、柱技術、與其他分析手段聯(lián)用技術及在生命科學醫(yī)藥食品應用上的全面研究。 ⑴ 毛細管電泳法的裝置 毛細管電 泳系統(tǒng) 的基本結構 [20,21]:高壓電源； 毛細管； 緩沖液池； 檢測器； 加樣系統(tǒng)。 圖 1 毛細管電泳裝置示意圖 Figure 1 capillary electrophoresis schematic diagram 進樣壓力 ： 虹吸進樣 進樣方式 ： 正極進樣 ， 負極檢測。 進樣高度差 ： 10 cm。 ⑵ 毛細管電泳法的原理 毛細管電泳的基本原理是基于離子或者荷電子在一定 pH 的自由溶液中以電場為驅動力 ， 在毛細管中按照電泳淌度的不同進行分離的一種模式 [22]。在毛細管電泳中有兩種基本策略可以 實現(xiàn)手性分離，一是構建手性分離環(huán)境，二是手性消除。由于手性消除反應需要昂貴的手性反應試劑，而且產(chǎn)物的手性可能不得恢復，所以多數(shù)人不愿意采取這種方法，轉而采用構建手性環(huán)境的方法。手性環(huán)境可以通過三種方法來構建：1. 使用手性添加劑。 2. 使用手性添加毛細管。 3. 使用手性涂層毛細管。其中除毛細管等點聚焦外，其他分離模式都可以用于手性分離 [23]，是較為有效的手性拆分技術。 7 ⑶ 毛細管電泳法的分離模式 目前， 根據(jù)分離機理不同， 毛細管電泳 大致 分 為 有以下幾種 模式 [24] ： 1. 毛細管區(qū)帶電泳 (capillary zone electrophoresis,CZE)，又稱毛細管自由電泳，用以分析帶電溶質。為了降低電滲流和吸附現(xiàn)象，可將毛細管內壁涂層。 它 是毛細管電泳中最基本、應用最普遍的一種模式。前述基本原理即是毛細管區(qū)帶電泳的基本原理。迄今為止 CZE 仍是應用最多的模式。 2. 毛細管凝膠電泳 (capillary gel electrophoresis,CGE)。在毛細管中裝入單體，引發(fā)聚合形成凝膠，主要用于測定蛋白質、 DNA 等大分子化合物。另有將聚合物溶液等具有篩分作用的物質，如葡聚糖、聚環(huán)氧乙烷，裝入毛細管中進 行分析，稱毛細管無膠篩分電泳，故有時將此種模式總稱為毛細管篩分電泳 [25] ，下分為凝膠和無膠篩分兩類。 3. 膠束電動毛細管色譜 (micellar electrokiic capillary chromatography, MECC)。在緩沖液中加入離子型表面活性劑如十二烷基硫酸鈉，形成膠束，被分離物質在水相和膠束相（準固定相）之間發(fā)生分配并隨電滲流在毛細管內遷移，達到分離。本模式能用于中性物質的分離。 4. 毛細管電色譜 (capillary electrochromatogryphy, CEC)。 它 是將高效液相色譜的固定相填充到毛細管中或在毛細管內壁涂布固定相，以電滲流為流動相驅動力的色譜過程，此模式兼具電泳和液相色譜 [26]的分離機制。 5. 毛細管等電聚焦電泳 (capillary isoelectric focusing, CIEF)。 它 是通過內壁涂層使電滲流減到最小，再將樣品和兩性電解質混合進樣，兩個電極槽中分別為酸和堿，加高電壓后，在毛細管內建立了 pH 梯度，溶質在毛細管中遷移至各自的等電點，形成明顯區(qū)帶，聚焦后用壓力或改變檢測器末端電極槽儲液的 pH 使溶質通過檢測器。 6. 毛細管等速電泳 (capillary esotachophoresis, CITP)。采用先導電解質和后繼電解質，使溶質按其電泳淌度不同得以分離。 以上各模式以 1 、 2 、 3 種應用較多。 此外，還有在這些 CE 基本分離模式基礎上利用各種技術建立起來的特殊的分離模式，如親和毛細管電泳 (利用生物分子或其他受體分子與其相應的專一分子可逆親和特性來進行電泳分離 )，毛細管矩陣電泳 [27](大量毛細管平行分離 )微毛細管電泳 [28] (將微系統(tǒng)技術應用于 CE，把化學反應的產(chǎn)物引入毛細管進行電泳分離 )等。 8 ⑷ 毛細管電泳法的特點 毛細管電泳除 了比其它色譜分離分析方法具有效率更高、速度更快、樣品和試劑耗量更少、應用面同樣廣泛等優(yōu)點外 [29]，其儀器結構也比高效液相色譜簡單。毛細管電泳只需高壓直流電源、進樣裝置、毛細管和檢測器。前三個部件均易實現(xiàn)，困難之處在于檢測器，特別是光學類檢測器。由于毛細管電泳溶質區(qū)帶的超小體積的特性導致光程太短，而且圓柱形毛細管作為光學表面也不夠理想，因此對檢測器靈敏度要求相當高 [30]。 ⑸ 毛細管電泳發(fā)在藥物分析中的應用前景 盡管毛細管電色譜 (CEC)技術的發(fā)展歷史并不長 ,但作為一個新興的分離分析技術 ,其研究和發(fā)展的生 命力最終必將體現(xiàn)在解決一些實際樣品分離分析時所具有的優(yōu)越性 ,因此 ,CEC技術發(fā)展到一定的階段后必定會伴隨著大量的實際應用 ,其結果又將促進 CEC 技術的研究和開發(fā)。本文將從已有的大量文獻報道中篩選出一些比較有代表性的應用實例進行介紹。 高效毛細管電泳 （ HPCE） 已應用到分析、分離的各個方面，且具有高靈敏度、高速、樣品耗用量少、重現(xiàn)性好、自動化等優(yōu)點，隨著商品化儀器的不斷改進，必將在分析領域得到更為廣泛的應用。 標準曲線法 標準曲線法也稱外標法或直接比較法，是一種簡便、快速的定量方法。具體方法是：用標準樣 品配制成不同濃度的標準系列，在與待測組分相同的色譜條件下，等體積準確進樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標準曲線，此標準曲線應是通過原點的直線。標準曲線的斜率即為絕對校正因子。 在測定樣品中的組分含量時，要用與繪制標準曲線完全相同的色譜條件作出色譜圖，測量色譜峰面積或峰高，然后根據(jù)峰面積和峰高在標準曲線上直接查出注入色譜柱中樣品組分的濃度。 標準曲線法的優(yōu)點是：繪制好標準工作曲線后測定工作就變得相當簡單，可直接從標準工作曲線上讀出含量，因此特別適合于大量樣品的分析。 9 重結晶提純 固體方法 重結晶提純法 [31]是有機反應分離固體粗產(chǎn)物的最常用的方法之一，其原理是利用混合物中各組分在某種溶劑中的溶解度不同，或在同一溶劑中不同溫度時的溶解度不同，而使它們分離開來。重結晶提純法的一般過程： ① 選擇溶劑； ② 溶解固體； ③ 除去雜質； ④ 晶體析出； ⑤ 晶體的收集與洗滌； ⑥ 晶體的干燥 [32]。其中，除去雜質步驟是重結晶操作關鍵步驟之一，主要采用趁熱過濾的方法除去不溶性雜質，活性炭吸附有色或某些樹脂狀、懸浮狀顆粒。趁熱過濾是重結晶操作成功與否的關鍵，如果操作不當，會導致產(chǎn)品的大量損失。傳統(tǒng)的趁熱過濾操作是采 用熱水漏斗過濾，理論上說熱水漏斗在能起到保溫作用，使漏斗內濾紙上溶液的溫度基本保持不變。但實際操作中發(fā)現(xiàn)，用熱水漏斗過濾的方法很難保持過濾溶液的溫度，特別是在環(huán)境溫度不高的情況下，溶液受環(huán)境溫度的影響非常大，溶液溫度下降很快，在濾紙上很快就有大量的晶體析出。 本課題的研究目的與意義 以 撲熱息痛 為研究對象， 以 毛細管電泳法 [33~35]為實驗手段， 用方法學做標準曲線，找出檢測限、定量限、 線性范圍，檢驗 其穩(wěn)定性、精密度。同時 測定不同樣品中撲熱息痛 的含量。 并與紫外分光光度法、高效液相色譜法 [36~40]進行 比較。 10 二 實驗部分 實驗儀器與試劑 撲熱息痛的提純 稱取粗 撲熱息痛少量 ，置于 250 mL 燒杯中 ，加入適量純水，加熱至沸騰，直至撲熱息痛 溶解，若不溶解，可適量添加少量熱水，攪拌并熱至接近沸騰使 撲熱息痛 溶解，稍冷后，加入適量活性炭于溶液中，煮沸 5~10 min，趁熱用放有折疊式濾紙的熱水漏斗過濾，用一 錐形瓶 收集濾液。 在過濾過程中，熱水漏斗和溶液均用小火加熱保溫以免冷卻。濾液放置冷卻后，有 撲熱息痛 晶體析出，抽氣過濾，用玻璃釘或玻璃瓶塞壓擠晶體，繼續(xù)抽濾，盡量除去母液，然后進行晶體的洗滌工作。取出晶體，放在表面皿上晾干，稱重 [41]。 HV30I 高壓電源 北京彩陸科學儀器有限公司 UVK2501 型紫外檢測器 北京彩陸科學儀器有限公司 CL1030 高效毛細管電泳儀 北京彩陸科學儀器有限公司 UV1201 型紫外可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司 pHS25 型 pH 計 上海精科雷磁公司 DL180 型超聲波清洗機 浙江省象山縣石油海天電子儀器廠 BS210 S 型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司 二次蒸餾水 實驗室自制 熔 融石英毛細管 （ 50 ?m .） 河北永年銳灃色譜器件有限公司 XT4A 顯微熔點測定儀（控溫型） 北京市科儀電光儀器廠 氫氧化鈉（分析純） 沈陽化學試劑廠 硼砂（ 分析 純） 開源化學試劑廠 撲熱息痛 實驗室自制 11 用 XT4A 顯微熔點測定儀（控溫型） 測 其熔點 是 172 ℃，即為撲熱息痛標準品。 實驗條件 波長的選擇 將 撲熱息痛的標準品 溶于二次蒸餾水制成約 10 ug/mL 的溶液，在 200~400 nm 范圍內紫外掃描，其紫外掃描圖見圖 1。撲熱息痛在 243 nm 處有最大吸收，故選擇 243 nm 為最佳檢測波長。 圖 2 撲熱息痛在 200~400nm 范圍內的紫外掃描圖 Figure 2 ultraviolet scan of paracetamol in 200 ~ 400 nm range 電泳條件 實驗考察了硼砂、硼砂 氫氧化鈉 、磷酸二氫鈉－硼砂 等作背景電解質，結果表明 50 mol/L 硼砂為 背景電解質 時，撲熱息痛樣品峰型最好 ，基線噪音最小 ；實驗繼續(xù)考察了背景電解質溶液 pH 為 ~ 時 撲熱息痛 樣品出峰情況，得出最佳 pH ，此時基線較穩(wěn)， 信噪比較高且穩(wěn)定 ，而且峰型也 最好；同時實驗考察了 分離電壓在10~20kV 范圍內，撲熱息痛出峰情況，最終選擇分離電壓 15kV，在此條件下，撲熱息痛樣品 10 min 內出峰。 由此得出最佳電泳條件： 12 背景電解質溶液： 精密稱取 g 硼 砂 適量溶于蒸餾水中， 用 10%磷酸和 M 氫氧化鈉調至 pH=。 操作條件：背景電解質和樣品溶液均經(jīng) mm 微孔濾膜過濾，并超聲脫氣。 毛細管：總長 50 cm，有效長度 45 cm，內徑 50 mm。 洗柱方式 ：毛細管柱依次用 mol/L 氫氧化鈉液 、二次蒸餾水、 背景電解質溶液各沖洗 10 min 后進樣；進樣間用二次蒸餾水、 背景電解質 溶液各沖洗 5 min 后進行下次進樣。 進樣方式：采用虹吸進樣，進樣高度差 10 cm，進樣時間 10 s，正極進樣負極檢測，檢測波長 243 nm。 進樣溫度 ：室 溫（ 20 ℃ ）。