【文章內容簡介】 ........................................................................ 64 參考文獻 ......................................................................................................................................... 65 附錄一：工藝流程圖 ..................................................................................................................... 69 附錄二：發(fā)酵罐示意圖 ................................................................................................................. 70 附錄三：車間布置平面圖 ............................................................................................................. 71 致 謝 .............................................................................................................................................. 73 浙江工業(yè)大學碩士學位論文 浙江工業(yè)大學碩士學位論文 I 生物催化法生產(chǎn) R扁桃酸及其年產(chǎn) 500 噸規(guī)模 的工廠工藝設計 摘 要 R扁桃酸是 一種重要的精細化工中間體和手性藥物前體，被廣泛應用于制藥與化工行 業(yè)。 生物催化法合成手性藥物具有條件溫和、催化效率高以及高度選擇性等優(yōu)點，并且無污染和能耗低，是一種環(huán)境友好型的綠色合成方法。腈水解酶作為生物催化法制備 R扁桃酸 的一種重要工業(yè)酶，得到了廣泛關注。 本文以腈水解酶產(chǎn)生菌重組 Q196S 為 研究 對象，優(yōu)化了重組腈水解酶的制備工藝，開發(fā)了 pH 連續(xù)調控工藝和甘油補加工藝，并在 30 L 發(fā)酵罐中經(jīng)放大驗證，產(chǎn)酶水平可提高至 24991 U/L。 研究了靜息細胞不對稱水解扁桃腈的轉化條件， 以及分批補料操作生產(chǎn)高濃度的 R扁桃酸 ，確定了最優(yōu)催化工藝條件：菌體濃度 50 g/L，加入1 mM 的 Ba2+和 1%(v/v)異辛醇作為助溶劑， 最適底物濃度 64 mM，pH ，反應溫度 45176。C 。經(jīng)過 h 的轉化時間后， R扁桃酸 的積累濃度可達到 587 mM， 99%。本文還進一步研究了反應混合液中R扁桃酸 的分離純化工藝 ， 在不影響 R扁桃酸 。 在小試研究基礎上，本文經(jīng)過中試工藝優(yōu)化及修正，確定了工藝放大法則采用 體積溶氧系數(shù) KLa=常數(shù)，以及在分離純化工段使用離浙江工業(yè)大學碩士學位論文 II 子交換層析代替萃取操作。通過工藝流程設計、物 料 衡算、能量衡算、車間布置設計、“ 三廢處理”及綜合利用等內容的設計，完成了年產(chǎn)500 噸純度 99%的 R扁桃酸 工廠工藝設計。 關鍵詞 生物催化，腈水解酶， R扁桃酸，工藝設計 浙江工業(yè)大學碩士學位論文 III BIOCATALYTIC SYNTHESIS OF RMANDELIC ACID AND PROCESS DESIGN OF 500 T/A SCALE ABSTRACT Rmandelic acid is the important fine chemical intermediates and chiral prodrug with broad uses in pharmaceutical and chemical industry. Synthetizing chiral drug with biological catalysis method has many advantages, such as mild conditions, high efficiency and high stereoselectivity, etc. In addition, it is nonpollution and low energy consumption, which is an environment friendly green synthesis method. As nitrilases are important industrial enzymes that convert mandelonitrile directly into the Rmandelic acid, they receive extensive attention. This dissertation is devoted to the prehensive understanding of the fermentation fundamental of nitrilase in the rebinant Q196S, optimizing the preparation technics of rebinant nitrilase and developing a novel technology of continuous regulating pH and glycerol fedbatch fermentation. Subseguently, the optimum process was verified in 30L fermenter, and the production of nitrilase was 24991 U/L. The paper investigated the bioconversion conditions of mandelonitrile to Rmandelic acid with resting cells and preparation of Rmandelic acid at 浙江工業(yè)大學碩士學位論文 IV high accumulative concentration with fedbatch. The optimal catalysis conditions are as follows: 50 g/L resting cells, 1 mM Ba2+, 1%(v/v) isooctanol as cosolvent, substrate 64 mM, pH and 45176。C. After continuous reaction for h， acquired 587 mM Rmandelic acid and the . value was 99%. Afterwards, the separation and purification of Rmandelic acid from the reaction mixture were studied. Based on lab experiment, the process conditions were investigated by magnified test and design of industrial production. After the process revised, KLa was the scaleup principle and extraction was replaced by ion exchange chromatography. To obtain process workshop of 500 tons Rmandelic acid per year, several contents, such as process design, material calculation, energy calculation, workshop layout design, ―three wastes‖ treatment and prehensive utilization were systematically investigated and designed. KEY WORDS: biocatalysis, nitrilase, Rmandelic acid, process design 浙江工業(yè)大學碩士學位論文 1 第一章 文獻綜述 簡介 單一構型 手性 藥物已成為當前國內外新藥開發(fā)和研究的 關注重點，手性技術在新藥研制中逐漸開始受到重視。手性藥物在 國內外 上市銷售的藥物總數(shù)中所占比例 正逐年上升， 2022 年全球范圍內上市的新藥已經(jīng)有 60%是單一構型藥物 [1]。據(jù)報道，手性藥物 2022 年銷售增長率超過 13%，達到 1330 億美元， 2022 年銷售額已達 2022 億美元 [2]。 自從歐洲爆發(fā)的“反應?！睉K劇后，人們開始逐漸意識到消旋藥物中的兩個對映異構體在人體中的藥理毒性、代謝過程以及藥理活性都存在著極大的差異 [3]。所以，美國食品及藥物管理局 FDA 規(guī)定 ，使用消旋體申報的新藥，需要提供關于消旋體和各對映異構體分別實施的毒理和藥理實驗報告，否則會被鑒定為藥物中含有 50%的雜質而不予批準，還規(guī)定包含手性分子藥物必須 以單一對映異構體形式申報。 由于存在著巨大的利潤還有市場需求，全球各大制藥企業(yè) 紛紛將 工作重點投入到手性藥物的研究開發(fā)，掀起了一陣手性藥物開發(fā)的熱潮。 扁桃酸 (mandelic acid， MA)又稱作苦杏仁酸、苯乙醇酸或 α羥基苯乙酸，兩種對映異構體結構如圖 11。 光學純 R扁桃酸 (RMA)是一種重要的精細化工中間體和手性藥物前體 [4]，廣泛應用于多種光學活性藥物的合成，如頭孢菌素和半合成青霉素等抗生素 [5, 6]、抗腫瘤藥物 [7, 8]、減肥藥物 [9]、農(nóng)藥 [10]及其他藥物 [11, 12]。以 R鄰氯扁桃酸為中間體的抗血小板聚集藥物氯吡格雷居全球最暢銷藥品排行榜第二位 [13]，對氯扁桃酸是新型卵菌綱病害殺菌劑雙炔酰菌胺的原料物質 [14]。RMA 還是重要的手性拆分劑和手性催化劑，而且還能用于測定手性物質的絕對構型及光學純度等等 。 RMA 被稱為“萬能”拆分劑 [15]，其對醇胺類藥物的拆分效果優(yōu)秀 [16]，如止咳藥甲嗎南的中間體八氫異喳琳衍生物 ，并且以 RMA 為催化劑可將芳香族及脂肪族醛均不對稱轉化成為相應手性 醇 [17, 18]。 浙江工業(yè)大學碩士學位論文 2 H O HO HOR 扁 桃 酸O HOH O HS 扁 桃 酸 圖 11 S扁桃酸和 R扁桃酸結構式 科學家們正在不斷 開發(fā) RMA 的新用途， RMA 的市場需求與此同時也在日益擴大。據(jù)統(tǒng)計，國際上已有部分公司有能力合成光學純 MA[19]，主要公司有日東化學公司、日本山川藥品公司以及德國瓦克公司等，但仍然不能滿足市場需求。目前，國內也已經(jīng)有部分企業(yè)能夠生產(chǎn)光學純的扁桃酸，但還沒有出現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)單一 構型的報道。因此，加大力度對單一構型扁桃酸的研究開發(fā)，打破國外企業(yè)對手性 RMA 的市場壟斷，并尋找出適合我國的工業(yè)化生產(chǎn)方法意義重大。 與此同時，研究出新的生產(chǎn)工藝用于 RMA 和其他手性藥物的工業(yè)生產(chǎn)，不僅對滿足我國光學活性藥物產(chǎn)品市場的需要具有實際意義，而且對解決手性技術領域所存在的多種問題也具有重大的理論指導意義。 RMA 的工業(yè)合成方法 最早產(chǎn)生也是 國內 目前仍在采用的 RMA 合成方法是 先合成外消旋的 MA，然后通過不對稱拆分方法得到光學活性的 RMA。外消旋 MA 的主要合成路線有三種 [20]，分別是 (1) 以苯甲醛為原料： C H OCHS O 3 N aO HN a H S O 3CHS O 3 N aO H N a C N CHO HC N N a2 S O 3C H C NO HH 2 O H C l C H C O O HO HN H 4 C l (2) 以苯為原料： 浙江工業(yè)大學碩士學位論文 3 COHC O O H CHO HC O O H (3) 以苯乙酮為原料： COC H 3h νC H 3 C O O H , C l 2COC H C l 2COC H C l 23 N a O H CHO HC O O N aCHO HC O O N aH C lCHO HC O O H 其中，以苯法合成外消旋 MA 水污染嚴重，三廢量大，而且成本較高；以苯甲醛為原料合成 MA 使用劇毒物氰化鈉，而且工藝路線長，投資費用高；以苯乙酮為原料合成 MA 三廢排放量小，工藝路線