【文章內(nèi)容簡介】 ........................................... 62 ........................................................................................................ 62 ...................................................................................................................... 63 7 結論 64 參考文獻 65 附錄 68 英語翻譯 76 英文原文 76 中文譯文 84 中國礦業(yè)大學 2022 屆本科生畢業(yè)設計 第 7 頁 1 緒論 纖維素酶簡介 纖維素作為植物光合作用的主要多糖類產(chǎn)物 ,是地球上最為豐富的可再生性天然資源。據(jù)估計 ,地球纖維素每年通過光合作用的更新量約為 4. 01010噸 ,Liitzen 等在 1983 年推算出纖維素的合成速率相當于全人類每人每天 70 千克 ,這一驚人的結果足以顯示其對整個人類的價值所在。然而 ,目 前約 80 %未被開發(fā)利用 ,具有極為誘人的前景。對纖維素的深入研究和利用必將是解決當前世界許多國家普遍面臨的糧食 ,飼料和能源短缺及環(huán)境污染等問題的一條有效途徑 ,并已成為 21 世紀各國共同關注的一項重大課題。 植物纖維素的高聚合度、毛細管結構、木質素和半纖維素所形成的保護層及其超分子結構中具有高結晶度 (crystallinity index) 的結晶區(qū)存有大量氫鍵 (包括分子鏈內(nèi)、鏈間及分子鏈與表面分子之間形成的氫鍵 ) 是造成纖維素難以被利用的根本原因。從高效和環(huán)保的角 度 出發(fā) ,纖維素被徹底分解而無污染的一條有效途 徑便是利用纖維素酶 (cellulase) 的水解作用。可是 ,當前纖維素酶的高昂費用是其難以在工業(yè)上被推廣應用的主要因素。過去的一些研表明 ,對含纖維素物質進行一定的前處理 (方法主要有球磨法 ,汽爆法 ,γ射線照射法 ,酸堿法和氧化法等 ) ,但僅是在較低的程度上提高了纖維素酶的水解效率。一些高產(chǎn)菌株的獲得 ,在目前條件下也難以大幅度降低纖維素酶的成本。還需要在這方面開展更廣泛而深入地研究。 纖維素酶 (cellulase)是利用產(chǎn)纖維素酶的菌株經(jīng)過固體發(fā)酵或液體深層發(fā)酵提取精制而成的液體狀酶制劑。纖維素酶由三種功能不同 但又互補的酶組成 ,能水解天然纖維素成為葡萄糖分子。這三種酶是內(nèi)切葡聚糖 ( )、外切纖維素酶 (cellobiohydrolase. CBH, EC 3. 2. 1. 91)和β 葡萄糖苷酶 (βGlucanases. GE, )。木酶屬被認為是纖維素酶系最全面 ,分解天然纖維素活力最高的一類絲狀真菌。纖維素酶對能源危機、食品和飼料緊張及環(huán)境污染等問題的解決有積極的作用 ,纖維素酶的開發(fā)利用將會產(chǎn)生很大的經(jīng)濟價值。 纖維素 (cellulose )是植物細胞壁的主要成分，約占植物干重的三分之一至二分之一。世界生產(chǎn)和目前儲存的纖維素生物量比任何一種碳水化合物都要多得多，是一種十分巨大的生物質資源，可為人類提供用之不盡的能源。但是目前這一資源的利用大約不到地球上總貯存量的 ，僅有一小部分被用于紡織、造紙、建筑、飼料、制藥、農(nóng)肥、燃料等方面，大部分未得到利用而被拋棄或焚燒，不僅造成資源的巨大浪費，而且污染環(huán)境，危害很大。如果能利用纖維素酶將大量的纖維素資源酶解成單糖，再經(jīng)發(fā)酵可生產(chǎn)出化工原料、飼料、燃料、食物和藥物等，開辟飼料、發(fā)酵工業(yè)原料和人類食品 的新來源，同時還可以處理廢物、減少公害、保護環(huán)境。因此研究纖維素資源的綜合利用具有深遠的意義，日益引起世界各國的關注和重視。 纖維素酶的研究狀況 中國礦業(yè)大學 2022 屆本科生畢業(yè)設計 第 8 頁 早期就有研究表明 ,纖維素酶是一類胞外酶 ,從培養(yǎng)物濾液中就可以很容易得到。它又屬于誘導酶 (但在細菌方面以固有酶居多 ) ,在誘導物存在下 ,才能大量產(chǎn)生。纖維素酶的分泌又受分解代謝產(chǎn)物阻遏 (catabolite repression) 和反饋抑制 (feedback inhibition) 兩種作用。許多不溶性的纖維素、可溶性的纖維衍生物、一些低聚糖類對某些單糖 和二糖均可作為纖維素酶的誘導物。但需要一提的是 ,纖維二糖、葡萄糖和甘油等低分子可溶性糖在低濃度時有促進作用而較高濃度時便開始抑制。當然 ,對于不同微生物來說 ,同一濃度的同一物質也可能有著不同甚至完全相反的作用。這方面的研究還甚少。 纖維素酶的分泌與細胞膜的通透性有著密切的關系 ,這是 Reese 和 Maguire 得出的結論 ,他們在綠色木霉 QMa6 的培養(yǎng)基中添加一定濃度的油酸鈉、亞油酸鈉、吐溫 80 和蔗糖單棕櫚酯等表面活性劑 ,結果都大量增加了纖維素酶產(chǎn)量 ,且縮短了產(chǎn)酶時間。在纖維素酶的生產(chǎn)過程中 ,pH 值和發(fā)酵 時間是關鍵。 Mandles等發(fā)現(xiàn) ,在分批培養(yǎng)物發(fā)酵過程中 ,起初 pH 最好是自然下降到 3. 0～ 3. 5 ,再加控制以防止pH 降低 ,消耗纖維素以后自然上升 ,這樣有利于酶的大量分泌。連續(xù)培養(yǎng)的情況不同 ,保持較低 pH 時 ,菌生長受到抑制 ,酶產(chǎn)量減少 ,而保持 pH5. 0 時則可提高酶產(chǎn)量。纖維素酶的發(fā)酵過程中 ,有分泌高峰期 ,且高峰期的穩(wěn)定性因培養(yǎng)基不同而有很大差異。故準確控制發(fā)酵時間是纖維素酶生產(chǎn)的另一個重要參數(shù)。綜合上述 ,這里引發(fā)了一個新思路 ,就是對發(fā)酵不同階段分別進行不同控制 (如 pH 值、溫度、通氣量、培養(yǎng)基 成分 ) 可能在很大程度上提高酶產(chǎn)量。 要獲得較高酶產(chǎn)量 ,發(fā)酵方法是非常重要的方面 ,目前生產(chǎn)纖維素酶的國家主要有日本、美國、德國和荷蘭。日本過去多用固體曲生產(chǎn) ,后來由于這種方法難于監(jiān)控 ,某些組分常常吸附于固體殘余物上 ,增加了提取難 度 ,不利于現(xiàn)代化流水作業(yè) ,于是不少改為液體深層發(fā)酵。美國一直都是使用這種方法 ,并在此基礎上出現(xiàn)了流加培養(yǎng)法、分批發(fā)酵法、連續(xù)發(fā)酵法、二次發(fā)酵法以及細胞循環(huán)法等等。混合微生物發(fā)酵法是纖維素酶生產(chǎn)中的又一新途徑。因不同真菌的纖維素酶系在各組分均衡性方面有互補的現(xiàn)象。木霉纖維素酶系中含有較 多的 CBH 和 EG,缺少β G,而另一類真菌如黑曲霉、海棗曲霉 ( A .phoenicus ) 和可可球二孢 ( Bot ryodi plodic theobromoe ) 形成的纖維素酶系卻以β G為主。故以微生物生態(tài)學為基礎 ,將以上兩類菌混合在一起發(fā)酵 ,尋求二者均能大量分泌纖維素酶的發(fā)酵方法和條件 ,生產(chǎn)出優(yōu)質高效的混合纖維素酶 ,目前只有極少關于這方面的淺層研究。 1906 年 Seilliere 發(fā)現(xiàn)蝸牛的消化液能夠水解棉花纖維素并產(chǎn)生葡萄糖，這是人類首次發(fā)現(xiàn)纖維素酶。隨后他的工作于 1913 年得到 Alexandrowicz 的證實。 1933年 Grassman 等研究了一種真菌的纖維素酶系，分辨出兩個組分，這是首次從真菌中分離出纖維素酶。四、五十年代，以美國陸軍 Natick 研究發(fā)展中心為代表的世界許多研究機構開始從不同方面對此進行了艱苦而卓有成效的探索，對產(chǎn)生纖維 中國礦業(yè)大學 2022 屆本科生畢業(yè)設計 第 9 頁 素酶的微生物進行了大量分離篩選工作，建立起較為完整的分離篩選方法。 1950 年 Reese 等提出纖維素酶作用方式的 GCx 假說以后，開始轉入纖維素酶的基礎研究，包括纖維素酶的性質、作用方式、培養(yǎng)條件和活力測定方法等等。六十年代以后， 由于分離技術的發(fā)展，推動了纖維素酶的分離純化工作，對纖維素酶的組分、作用方式以及誘導作用等方面的研究進展比較快 :并且實現(xiàn)了纖維素酶制劑的工業(yè)生產(chǎn) 。在應用上也取得了一定成績。早在 1967 脾國外專利中就提出了用纖維素酶來消除棉織物上出現(xiàn)的微纖維 (絨毛小球 )的想法 .但這個想法一直未能實現(xiàn)。直到 1985 年，采用腐殖根霉 (Humicola insolens)發(fā)酵的方法，制得了世界上第一個洗滌劑用的纖維素酶，其產(chǎn)品命名為 Cellulaseo 1987 年又推出了一種細菌纖維素酶 (Bacterial CeIlulase)， 并成功地用于 Attack 洗衣粉。從此，纖維素酶也就正式加入了洗滌劑酶的行列 。 從上世紀八十年代開始，隨著分子生物學和基因工程的發(fā)展，人們開始利用基因工程的方法對纖維素酶基因進行克隆和一級結構的測定，利用遺傳工程從分子生物學水平對纖維素酶生產(chǎn)菌株進行誘變育種，并對纖維素酶蛋白質的氨基酸序列及其分離純化等方面進行了深入細致的研究。到目前為止，在 SWISSPROT蛋白質數(shù)據(jù)庫中，已有 140 個內(nèi)切酶， 19 個外切酶和 102 個 Q_葡萄搪普酶的全序列 。1988年開始利用結構生物學及蛋白質工程的方法對纖維素酶分子 的結構和功能進行研究，包括纖維素酶結構域的拆分與解析、功能性氨基酸的確定、水解的雙置換機制的確立、以及分子折疊和催化機制關系的探討。然而由于纖維素酶蛋白結晶困難，現(xiàn)在關于纖維素酶分子結構與功能關系的研究進展仍比較緩慢。 國內(nèi)研究概況 我國纖維素酶的研究開始于 20 世紀 60 年代初。幾十年來，北京、上海、成都、無錫、廣東、山東、浙江等地的大專院?？蒲性核M行了纖維素酶的研究工作，選育出一批纖維素酶菌種。如 1968 年北京選育出一批纖維素酶菌種 。1970 年后中國科學院上海植物生理研究所等單位利用誘變 方法獲得了產(chǎn)酶能力較高的變異株，并進行了生產(chǎn)試驗。 70 年代后，繼續(xù)進行纖維素酶產(chǎn)生菌的誘變與選育工作，并對各種微生物來源的纖維素酶組分進行分離純化、結構和酶學性質的研究 。關于纖維素酶的特性、作用機理、培養(yǎng)條件、應用試驗等方面的報道文獻也較多，如王景林等在吸收國內(nèi)外經(jīng)驗的基礎土，先后引進綠色木霉 Sn9101康氏木霉 NT15,E 曲霉 XX15A，在此基礎上采用了紫外線特定電磁波輻射，線性加速器，亞硝基皿等物理化學的誘變方法獲得了高產(chǎn)菌株 NT15H， NT15HXT15H,XT15H10。 其中木霉 NT15H固體培養(yǎng)活力經(jīng)輕工業(yè)部食品質量監(jiān)督檢測中心南京站檢側表明己達到國際先進水平 。王成華等采用里氏木霉 A3，進行紫外線和業(yè)硝基呱復合誘變后，得到了產(chǎn)纖維素酶活力較高的里氏木霉 91 一菌株 。張中良采用均勻設計研究了影響綠色木霉生產(chǎn)纖維素酶的主要因素，他采用了淺盤固體發(fā)酵，得出了綠色木霉生產(chǎn)纖維素 中國礦業(yè)大學 2022 屆本科生畢業(yè)設計 第 10 頁 酶的最佳條件 。張荃花等以康氏木霉為菌種進行固體發(fā)酵，首先對菌種進行了誘變，并利用酵母菌與康氏木霉間的徽生態(tài)關系進行混合發(fā)酵，防止了“白毛菌”的污染，提高了酶活力 。陳春洪等以稻草、花生殼為主要碳源，研究了里氏 木霉 GAB 的產(chǎn)酶條件。尹清強等在黑白花奶牛日糧中添加纖維素酶 50g/頭‘天，產(chǎn)奶量提高%，飼料效率提高 %。裴相元等在鵝日糧中加入 %纖維素酶后，結果提高了 %的日增重和 %的飼料效率及降低了 %的飼料消耗。 從 80 年代后期開始有不少的國內(nèi)學者對纖維素酶進行基因結構與遺傳重組方面的研究。如汪天虹等人用鳥槍法從野油菜黃單胞菌 S152 中克隆到的內(nèi)切纖維素酶基因，在大腸桿菌中得以表達 。從微紫青霉中克隆到的 CBHI 基因在體外無細胞系統(tǒng)中表達 。從瑞氏木霉 DNA 文庫中克隆到 的內(nèi)切葡纖維素酶 III 基因在釀酒酵母中表達 :肖志壯等從里氏木霉 DNA 文庫中分離得到了內(nèi)切葡聚搪酶侄。玲列，將其重組到釀酒酵母 H158 中得到表達 。王建榮等以噬菌體 lambds EMBL3 DNA 為載體，通過克隆綠色木酶 (Trichoderma viride)高分子量基因組 DNA 的部分酶解片段，并將重組分子進行體外包裝后侵染 K802，由此構建了綠色木霉基因文庫（ taie}中科院微生物研究所還專門成立了纖維素酶研究的課題組，通過收集文獻與實驗數(shù)據(jù)進行基礎理論的研究。 20 世紀 80 年代中期上海就生產(chǎn)出 纖維素酶。 20世紀 90 年代初黑龍江省海林市萬力達集團公司首條年產(chǎn) 2022t 的纖維素酶生產(chǎn)線投產(chǎn)，但迄今為止，我國規(guī)模生產(chǎn)纖維素酶至今仍未解決，形成不了大批量生產(chǎn)，滿足不了市場的需要。因此，丹麥諾和諾德公司的酶制劑產(chǎn)品占領了我國絕大部分市場，使進口纖維素酶價格昂貴。 纖維素酶的應用 纖維素酶在果實和蔬菜加工上的應用 在果實和蔬菜加工過程中為了使植物組織軟化膨潤，一般用過度 的加熱蒸 煮，酸堿處理等，這樣就使果蔬的香味和維生素損失大。用纖維素酶進行菜的軟化可避免上述缺點。另外，可以用纖維素酶分解 果實和蔬菜，這樣制成的果醬口感好。也可用纖維素酶分解蘑菇，制造一種新調(diào)味料。在糖漬果品加工中最近也用纖維素酶取得很好的結果，用砂糖漬果實時，砂糖要通過細胞壁慢慢浸人果實中，這樣就需要幾天的時間，若是用纖維素酶破壞細胞后，在短時間內(nèi)即可浸透進去。椰子餅中含有很高的蛋白質和脂肪，糖類含量也很高，但是卻不能作為糧食使用，因其纖維素含量較高，所以要用纖維素酶分解纖維素。其酶解工藝如下：首先把椰子餅加一定量水蒸煮后，加人纖維素酶， pH4． 5， 40℃振蕩， 48h后過濾，濾液濃縮噴霧干粉，此粉含有脂肪、糖、蛋白質。纖維