生物化學第四章蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)(編輯修改稿)
2025-02-12 13:45 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 C H CR OH N C H CR O OR nCC HH N O Hn 1N 端氨基酸 C 端氨基酸OR nCC HH 2 N O HH 2 N C H CR ON H N H 2 +H+N H 2 N H 2氨基酸酰肼 C 端氨基酸20221214 上海大學生命科學學院 ? 此法是多肽鏈 C末端氨基酸分析法。 ? 多肽與 LiBH4在無水條件下加熱， C端氨基酸被還原為醇即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則不變。醇很容易與其余氨基酸分離。 C 末端基氨基酸測定 LiBH4法 20221214 上海大學生命科學學院 ? 羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C端逐個的水解 AA。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的 C末端殘基順序。 ? 目前常用的羧肽酶有四種： A,B,C和 Y； A和 B來自胰臟； C來自柑桔葉； Y來自面包酵母。 ? 羧肽酶 A能水解除 Pro,Arg和 Lys以外的所有 C末端氨基酸殘基； B只能水解 Arg和 Lys為 C末端殘基的肽鍵。 C 末端基氨基酸測定 羧肽酶 (carboxypeptidase)法 （ 三 ） 二硫橋的斷裂 斷裂二硫橋的主要方法是過甲酸氧化法和巰基化合物還原法 。 s s HCOOOH SO3H SO3H 20221214 上海大學生命科學學院 S S S S S S 胰島素 HOCH2CH2SH SH SH SH SH SH SH SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H SCH2C00H ICH2COOH 20221214 上海大學生命科學學院 作用： 這些反應(yīng)可用于巰基的保護 。 O O C C H C H2 S HN H 3 +C H 2 O C C lO O O C C H C H2 SN H 3 +O C C H 2OC H 2 O O C C H C H 2 SN H 3 +C H 2 C lI C H 2 C N H 2OC H 2 C N H 2O O O C C H C H2 SN H 3 +巰基（SH）的保護 20221214 上海大學生命科學學院 ?還可用碘乙酸 — ICH2COO 保護，在多肽鏈中引入負電荷。亦可用碘乙酰胺 — ICH2CONH2 保護。 ?如用乙撐亞胺保護巰基，生成氨乙基半胱氨酸 AECys，在肽鏈中引入胰蛋白酶的酶切位點。 巰基（SH）的保護 20221214 上海大學生命科學學院 （四）氨基酸組成的分析 用于蛋白的氨基酸組成測定的水解方法主要是酸水解 ，同時輔以堿水解 。 氨基酸分析儀圖譜 20221214 上海大學生命科學學院 酸水解 ? 常用 6 mol/L的鹽酸或 4 mol/L的硫酸在105110℃ 條件下進行水解 ， 反應(yīng)時間約 20小時 。 ? 此法的優(yōu)點是不容易引起水解產(chǎn)物的消旋化 。 缺點是 色氨酸 被沸酸完全破壞； ? 含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解； 門冬酰胺和谷氨酰胺 側(cè)鏈的酰胺基被水解成了羧基 。 20221214 上海大學生命科學學院 堿水解 ? 一般用 5 mol/L氫氧化鈉煮沸 1020小時 。 ? 由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞 ， 產(chǎn)率不高 。 ? 部分的水解 產(chǎn)物發(fā)生消旋化 。 ? 主要用來測定色氨酸含量 20221214 上海大學生命科學學院 （五）多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化 目前用于蛋白質(zhì)肽鏈斷裂的蛋白水解酶（ proteolytic enzyme）或稱蛋白酶（ proteinase）已有十多種。如： 胰蛋白酶 ，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶 應(yīng)用酶水解多肽，不會破壞氨基酸，也不會發(fā)生消旋化， 色氨酸 在水解中也不受破壞。水解的產(chǎn)物為較小的 肽 段。 最常見的蛋白水解酶有以下幾種： 20221214 上海大學生命科學學院 胰蛋白酶 (trypsin) 這是最常用的蛋白水解酶 ， 專一性強 ，只斷裂賴氨酸或精氨酸的羧基參與形成的肽鍵 。 得到的是以 Arg或 Lys為 C末端殘基的肽段 ，肽段數(shù)目等于多肽鏈中 Arg和 Lys總數(shù)加 1。 20221214 上海大學生命科學學院 為了減少胰蛋白酶的作用位點 ， 可以通過化學修飾將其側(cè)鏈基因保護起來 。 用馬來酸酐可以保護 Lys殘基側(cè)鏈上的 ε －NH2， 胰蛋白酶就不會水解 Lys竣基參與形成的肽鍵 ， 只能斷裂 Arg羧基所形成的肽鍵；反之 ， 如果用 1， 2－環(huán)己二酮修飾Arg的胍基 ， 則胰蛋白面只能裂解 Lys羧基所形成的肽鍵 。 如果想增加多肽鏈中胰蛋白酶的斷裂點 ， 可以用丫丙啶處理多肽鏈樣品 ， 這時 Cys殘基側(cè)鏈被修飾成類似 Lys的側(cè)鏈 ， 也具有 ε － NH2。 這樣胰蛋白酶便能斷裂 Cys羧基端的肽鍵 。 N H C H COR 4N H C H COR 3N H C H COR 2N H C H COR 1R1=Lys和 Arg側(cè)鏈（專一性較強，水解速度快）。 R2=Pro 水解受抑。 20221214 上海大學生命科學學院 糜蛋白酶 (chymotrypin)或胰凝乳蛋白酶 (Chymotrypsin)：它斷裂 Phe、 Trp和 Tyr等疏水氨基酸的羧基參與形成的肽鍵 。斷裂鍵鄰近的基團是堿性的 ， 裂解能力增加；是酸性的 ， 裂解能力將減弱 。 N H C H COR 4N H C H COR 3N H C H COR 2N H C H COR 1肽鏈 水解位點 R1=Phe, Trp,Tyr時水解快 。 R1= Leu， Met和 His水解稍慢 。 R2=Pro 水解受抑 。 20221214 上海大學生命科學學院 N H C H COR 4N H C H COR 3N H C H COR 2N H C H COR 1肽鏈 水解位點 胃蛋白酶 (pepsin) 它要求被斷裂鍵兩側(cè)的殘基都是疏水性氨基酸 ， 如 PhePhe。 此外與糜蛋白酶不同的是酶作用的最適 pH， 前者是 pH2， 后者是 pH89， 由于二硫鍵在酸性條件下穩(wěn)定 ， 因此確定二硫鍵位置時 ， 常用胃蛋白酶來水解 。 R1和 R2＝ Phe, Trp, Tyr。 Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度較快。 R1=Pro 水解受抑。 20221214 上海大學生命科學學院 N H C H COR 4N H C H COR 3N H C H COR 2N H C H COR 1肽鏈 水解位點 嗜熱菌蛋白酶（ thermolysin） :常用于斷裂較短的多肽鏈。 R2=Phe, Trp, Tyr。 Leu， Ile, Met以及其它疏水性強的氨基酸水解速度較快。 R2=Pro或 Gly
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