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向內皮細胞分化的骨髓間充質干細胞體外三維構建組織工程心臟瓣膜的實驗研究(編輯修改稿)

2025-02-11 01:59 本頁面
　

【文章內容簡介】 全浸沒，室溫下放置1 h預處理后用于構建TEHV。 　　 TEHV體外構建方法 以多次沉淀法細胞支架接種技術將MSCECs以2105 cm2種植密度,間隔24 h 3次接種于以Fn預處理過的去細胞豬主動脈瓣膜支架雙側內膜面上,然后靜態(tài)培養(yǎng)7 d構建TEHV。 　　 構建的TEHV瓣葉的組織學研究 將體外構建的TEHV瓣葉,分別以福爾馬林及4%多聚甲醛行HE染色，免疫組織化學測定及掃描電鏡檢查。 　　2 結 果 　　 MSCECs的體外培養(yǎng)、擴增及形態(tài)學特點 原代培養(yǎng)接種2～4 h后細胞開始貼壁，2～3 d就可見一些集落形成，10～14 d融合90%,呈松散的網格狀排列。MSCECs基本上為梭形的成纖維細胞狀形態(tài)。傳代培養(yǎng)后的細胞不再以成集落的方式生長，而是均勻分布生長，1∶3傳代后一般5～7 d即可融合90%，其超微結構顯示，MSCECs核/質比例大，細胞質內細胞器不發(fā)達，表現(xiàn)出干細胞的特點，但胞質內分泌小泡增多，中間絲過度表達，可見內皮細胞特征性的WeiblePalade(WP)小體(圖1)。其生長曲線見圖2。 　　A：倒置相差顯微鏡下形態(tài)，梭形的成纖維細胞狀均勻分布生長( 200)。B：透射電鏡下形態(tài)，核/質比例大，細胞質內分泌小泡增多，箭頭處WP小體( 30 000). 　　 MSCECs的表型鑒定及細胞功能測定 細胞免疫化學顯示ΑSMA及Vimentin染色陽性，同時CD31及Ⅷ因子染色亦為陽性(圖3)。細胞培養(yǎng)上清液NO及 ET1分別為(177。)Μmol/L及(177。)ng/L，同時以MSCs為對照組，同樣條件下測定NO及ET1分別為(177。)Μmol/L及(177。)ng/L。2組比較，MSCECs組中NO明顯高于MSCs組(P),ET1無明顯差異。 　　 去細胞豬主動脈瓣支架的組織學檢查 豬主動脈瓣葉,主動脈內膜面及瓣下心內膜的內皮細胞及間質細胞去除完全。彈力纖維及膠原纖維結構保留完好(圖3A,B)。掃描電鏡結果示:去細胞瓣葉表面膠原纖維束排列完整,保存良好,瓣葉表面無內皮細胞附著(圖3C)。 　　 構建的TEHV的形態(tài)學檢查 HE染色：MSCECs在支架上表面形成連續(xù)的細胞層，支架基質中未見細胞生長，免疫組織化學結果示：ΑSMA及Ⅷ因子染色陽性(圖4)。掃描電鏡結果示：瓣膜表面細胞扁平,細胞間隙較大，細胞排列有一定極性(圖5)。 　　A：主動脈內膜面及瓣下心內膜的內皮細胞及間質細胞去除完全(HE染色，100)。B：彈力纖維及膠原纖維結構保留完好(VB染色，100)。C：去細胞瓣葉表面膠原纖維束排列完整,保存良好,瓣葉表面無內皮細胞附著(掃描電鏡，2 000)。D：肉眼觀察，主動脈瓣支架保持了主動脈根部的完整結構(三維去細胞支架). 　　A：支架上表面形成連續(xù)的細胞層,支架基質中未見細胞生長(HE染色，100)。B：Ⅷ因子免疫組織化學染色(400)。C：ΑSMA免疫組織化學染色(200)。D：瓣膜表面細胞扁平,細胞間隙較大，
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