向內(nèi)皮細(xì)胞分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外三維構(gòu)建組織工程心臟瓣膜的實驗研究(編輯修改稿)
2025-02-11 01:59 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 全浸沒，室溫下放置1 h預(yù)處理后用于構(gòu)建TEHV。 TEHV體外構(gòu)建方法 以多次沉淀法細(xì)胞支架接種技術(shù)將MSCECs以2105 cm2種植密度,間隔24 h 3次接種于以Fn預(yù)處理過的去細(xì)胞豬主動脈瓣膜支架雙側(cè)內(nèi)膜面上,然后靜態(tài)培養(yǎng)7 d構(gòu)建TEHV。 構(gòu)建的TEHV瓣葉的組織學(xué)研究 將體外構(gòu)建的TEHV瓣葉,分別以福爾馬林及4%多聚甲醛行HE染色，免疫組織化學(xué)測定及掃描電鏡檢查。 2 結(jié) 果 MSCECs的體外培養(yǎng)、擴增及形態(tài)學(xué)特點 原代培養(yǎng)接種2～4 h后細(xì)胞開始貼壁，2～3 d就可見一些集落形成，10～14 d融合90%,呈松散的網(wǎng)格狀排列。MSCECs基本上為梭形的成纖維細(xì)胞狀形態(tài)。傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞不再以成集落的方式生長，而是均勻分布生長，1∶3傳代后一般5～7 d即可融合90%，其超微結(jié)構(gòu)顯示，MSCECs核/質(zhì)比例大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器不發(fā)達，表現(xiàn)出干細(xì)胞的特點，但胞質(zhì)內(nèi)分泌小泡增多，中間絲過度表達，可見內(nèi)皮細(xì)胞特征性的WeiblePalade(WP)小體(圖1)。其生長曲線見圖2。 A：倒置相差顯微鏡下形態(tài)，梭形的成纖維細(xì)胞狀均勻分布生長( 200)。B：透射電鏡下形態(tài)，核/質(zhì)比例大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分泌小泡增多，箭頭處WP小體( 30 000). MSCECs的表型鑒定及細(xì)胞功能測定 細(xì)胞免疫化學(xué)顯示ΑSMA及Vimentin染色陽性，同時CD31及Ⅷ因子染色亦為陽性(圖3)。細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO及 ET1分別為(177。)Μmol/L及(177。)ng/L，同時以MSCs為對照組，同樣條件下測定NO及ET1分別為(177。)Μmol/L及(177。)ng/L。2組比較，MSCECs組中NO明顯高于MSCs組(P),ET1無明顯差異。 去細(xì)胞豬主動脈瓣支架的組織學(xué)檢查 豬主動脈瓣葉,主動脈內(nèi)膜面及瓣下心內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞去除完全。彈力纖維及膠原纖維結(jié)構(gòu)保留完好(圖3A,B)。掃描電鏡結(jié)果示:去細(xì)胞瓣葉表面膠原纖維束排列完整,保存良好,瓣葉表面無內(nèi)皮細(xì)胞附著(圖3C)。 構(gòu)建的TEHV的形態(tài)學(xué)檢查 HE染色：MSCECs在支架上表面形成連續(xù)的細(xì)胞層，支架基質(zhì)中未見細(xì)胞生長，免疫組織化學(xué)結(jié)果示：ΑSMA及Ⅷ因子染色陽性(圖4)。掃描電鏡結(jié)果示：瓣膜表面細(xì)胞扁平,細(xì)胞間隙較大，細(xì)胞排列有一定極性(圖5)。 A：主動脈內(nèi)膜面及瓣下心內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞去除完全(HE染色，100)。B：彈力纖維及膠原纖維結(jié)構(gòu)保留完好(VB染色，100)。C：去細(xì)胞瓣葉表面膠原纖維束排列完整,保存良好,瓣葉表面無內(nèi)皮細(xì)胞附著(掃描電鏡，2 000)。D：肉眼觀察，主動脈瓣支架保持了主動脈根部的完整結(jié)構(gòu)(三維去細(xì)胞支架). A：支架上表面形成連續(xù)的細(xì)胞層,支架基質(zhì)中未見細(xì)胞生長(HE染色，100)。B：Ⅷ因子免疫組織化學(xué)染色(400)。C：ΑSMA免疫組織化學(xué)染色(200)。D：瓣膜表面細(xì)胞扁平,細(xì)胞間隙較大，
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