第一節(jié)克隆載體(編輯修改稿)
2024-11-22 12:56 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 細(xì)菌時(shí)，只是 DNA侵入，然后利用細(xì)菌的酶來(lái)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯。 λ DNA載體的構(gòu)建 λ 噬菌體的缺陷： ? 基因組太大（ ）； ? 酶切點(diǎn)太多，它有 5個(gè) BamH1位點(diǎn)（ G↓GATCC ）， 6個(gè)BgⅠ 位點(diǎn)（ A↓GATCT ）， 5個(gè) EcoRⅠ 位點(diǎn)（ G↓AATTC ）。 ? 野生型只能接納一定長(zhǎng)度的 DNA。若相當(dāng)于 λ 噬菌體的 75105%，那么只能接納 5%=DNA。 ? 重組的 λDNA 分子難于直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞 — 利用體外包裝成病毒顆粒，然后通過(guò)感染的方法注入 DNA。 切去部分非必須的區(qū)域； 抹去多余的限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)； 插入可供選擇的標(biāo)記基因； 建立體外包裝系統(tǒng)。 構(gòu)建 λ噬菌體克隆載體的基本策略： 插入型載體、取代型載體 ?根據(jù)切除的多少，將 λDNA分為兩大類載體： 縮短長(zhǎng)度 野生型 :上限 51kb λDNA： ，外源基因 λDNA上有 4050%的 DNA是復(fù)制，裂解所不必需的，切除便提高裝載量。 插入型載體（ insertion vector） 經(jīng)改造后 只具有 一個(gè) 可供外源 DNA插入的 克隆位點(diǎn) ,長(zhǎng)度為 37kb，為包裝的下限，它本身也能被包裝，允許插入片段最大為 14kb. 必須攜帶標(biāo)記基因 取代型載體（ substitution vector） 具有 成對(duì)的克隆位點(diǎn) ,空載的載體 DNA只 26kb，不能被包裝，無(wú)法進(jìn)入受體
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