【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ropolis as a biological source of drugs， have a certain value and significance to the production of the anic tobacco. Keyword : Tobacco bacterial wilt。 Pseudomonas solanacearum 。 propolis。 control。 effect 蜂膠對(duì)煙草青枯病防治效果的初步研究 3 煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在云南省一些經(jīng)濟(jì)落后的貧困地區(qū)，許多農(nóng)民靠種植煙草維系生活，是山區(qū)農(nóng)民脫貧致富，提高生活水平的有效途徑。在煙草種植過(guò)程中，煙草病害是影響煙草產(chǎn)量、品質(zhì)的重要因素，因此世界各煙草栽培國(guó)均高度重視病害防治。 根據(jù) 1997 年我國(guó) 16 個(gè)產(chǎn)煙省 (區(qū) )的調(diào)查，目前有煙草侵染性病害 68 種，其中主要病害 15 種。已鑒定的 62 種病害中，真菌性病害 30 種、細(xì)菌性病害 8 種、病毒病害 17 種、類(lèi)菌原體病害 2 種、線蟲(chóng)病害 3 種及寄生性種子植物 2 種 。其中有 15種主要煙草病害，他們是 (按為害嚴(yán)重程度及分布范圍為序 )普通花葉病毒病、黃瓜花葉病毒病、赤星病、黑脛病、炭疽病、青枯病、野火病、馬鈴薯 Y 病毒病、蛙眼病、根結(jié)線蟲(chóng)病、空莖病 、猝倒病、角斑病、根黑腐病、蝕紋病毒病。真菌病害中，煙草黑脛病、 根黑腐病 和赤星病為害最為嚴(yán)重。 細(xì)菌病害中，為害最為嚴(yán)重的是煙草青枯病和煙草野火病。病 毒病害中，煙草普通花葉病和煙草黃瓜花葉病最為嚴(yán)重，其次是煙草馬鈴薯 Y 病毒病 [1]。 近年來(lái)烤煙苗期病害越來(lái)越嚴(yán)重，對(duì)煙苗造成了嚴(yán)重影響。做好煙草苗期病害的綜合防治，是培育足夠壯苗、提高 煙葉產(chǎn)、質(zhì)量，獲得較好經(jīng)濟(jì)效益的基礎(chǔ)性工作。目前烤煙苗期病害最普遍、嚴(yán)重的病害主要有煙草炭疽病，猝倒病，立枯病和病毒病。 煙草青枯病是熱帶、亞熱帶地區(qū)煙草的重要病害， 1880 年該病首先在美國(guó)的北卡羅來(lái)納州格蘭維爾 （ Granville） 被發(fā)現(xiàn)，故當(dāng)時(shí)被廣泛稱(chēng)為格蘭維爾凋蔫病，在中國(guó)則俗稱(chēng)為 “煙瘟 ”、 “半邊瘋 ”[2]。 1940 年前后，該病在美國(guó)和印度尼西亞的為害最為嚴(yán)重，此后，在許多產(chǎn)煙國(guó)家逐漸演變?yōu)闊煵萆系闹匾『?，如日本、澳大利亞、韓國(guó)等 [2]。 目前在中國(guó)，長(zhǎng)江流域及其以南煙區(qū)普 遍發(fā)生，個(gè)別年份常常暴發(fā)流行，造成毀滅性損失。近幾年來(lái)，該病的發(fā)病和為害范圍有向北方煙區(qū)擴(kuò)展的趨勢(shì)，在山東、河南、陜西及遼寧等省都有發(fā)生，局部地區(qū)為害較重。云南省煙草青枯病早在 1987 年就有報(bào)道，但危害一直較輕 [3,4]。自 2022 年以來(lái)，云南省南部旱地?zé)焻^(qū) ， 煙草青枯病危害上升速度很快，局蜂膠對(duì)煙草青枯病防治效果的初步研究 4 部地塊發(fā)病率達(dá)到 80％以上，且常與煙草黑脛病混合發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)可使全田煙草枯死 [5]。目前 ， 該病造成的損失已居各類(lèi)病害的第 4 位，必須重視該病的防治工作。 煙草青枯病病原曾用名 Pseudomonas solanacearum Smith[2] 或 Burkholderia solanacearum[3]。 1996 年由 IJSB 正式更名為青枯雷爾氏菌（ Ralstonia soanacearum E F Smith） [3,4]。此后，在國(guó)際重大刊物上發(fā)表的文章均使用該名。菌體桿狀，革蘭氏染色陰性，菌體大小為 ～ ～ μm，極生鞭毛 1～ 4 根，不形成莢膜和芽孢，為好氣性細(xì)菌，在兼氣下培養(yǎng)，其毒力迅速喪失。不同寄主上的菌落形態(tài)無(wú)明顯差異。病菌生長(zhǎng)的溫度范圍為 18～ 37 ℃ ，最適溫度 30～ 35 ℃ ， 致死溫度為 52 ℃ ，持續(xù) 10 min； pH 值 4～ 8，最適為 。煙草青枯病菌在病殘?bào)w中可以存活 7 個(gè)月，在土壤或堆肥中可存活 2～ 3 年以上，有的竟達(dá) 8～ 25 年，但在干燥的條件下很快就死亡，在種子表面的病菌 2 d 后即可全部死亡。在 TTC 培養(yǎng)基上，菌落中央呈粉紅色，周?chē)榘咨鲃?dòng)性較強(qiáng)（鄭繼法等， 1998） [6]。 煙草青枯病屬典型的維管束病害，根、莖、葉各部位均可受害，但以為害根、莖為主。最典型的癥狀是：葉片枯萎后仍呈綠色，故稱(chēng) “青枯病 ”。在病株發(fā)病的一側(cè)，葉片枯萎，無(wú)病的一側(cè)葉片生長(zhǎng)正常 ，呈現(xiàn) “半邊瘋 ”癥狀。莖部發(fā)病后，外表出現(xiàn)黑色條斑，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)黑色條斑一直延伸到煙株頂部，將病株莖部橫切，可見(jiàn)維管束變成褐色，用力擠壓切口，會(huì)從導(dǎo)管中滲出黃白色乳狀粘液，即細(xì)菌 “菌膿 ”[7]。受 煙草青枯病 菌 感染的煙株一般仍然保持直立，不折倒，未摘除的病葉緊貼莖稈上?？竞蟀Y狀：病葉烤后，單葉重減少，光滑，等級(jí)下降，化學(xué)成份失調(diào)。發(fā)病煙葉半片變黃或全片葉變黃時(shí)采收，烤后葉色為半葉或全葉雜色；整株煙全部枯萎變黃采收烘烤，烤后葉片為糟片，多為級(jí)外煙 [8]。 青枯雷爾氏菌 (Ralstonia solanacearum)寄主范圍雖然廣泛，但菌株間的致病性具有明顯寄主專(zhuān)化性 [9,10]。 Budenhagen 1964 年依據(jù)不同寄主的致病性，將供試青枯菌株分為 3 個(gè)小種 [11]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn) ， 桑樹(shù)青枯菌株的致病性與 3 個(gè)小種都具有明顯差異，稱(chēng)為小種 4[9,12]。煙草青枯菌屬于小種 1，只能侵染茄科植物。而且進(jìn)一步蜂膠對(duì)煙草青枯病防治效果的初步研究 5 的 研究表明，不同地區(qū)來(lái)源的煙草青枯病菌株， 對(duì)其他不同寄主植物的致病性以及對(duì)煙草不同品種的致病性都有顯著差異 [13]。王國(guó)平等根據(jù)煙草青枯病菌 株 對(duì)烤煙品種MSK326 的平均致病病級(jí)不同 ， 分為強(qiáng) 、中和弱 致病類(lèi)群，大多數(shù)調(diào)查地點(diǎn)強(qiáng)、弱致病類(lèi)群并存，這表明煙草青枯病菌株 間有很大的致病性差異。 青枯菌的致病性在人工培養(yǎng)基上還很容易減弱或喪失，從 TTC 培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)可以鑒別致病性不同的菌落。致病性強(qiáng)的野生型菌株，菌落一般較大，稍凸起，不規(guī)則圓形，中央粉紅色，邊緣乳白色，對(duì)光觀察可見(jiàn)有輪紋，流動(dòng)性較強(qiáng)；弱毒或無(wú)毒菌株的菌落一般較小，圓形，中央深紅色，白邊較窄或無(wú)白邊，菌落表面粗糙或光滑有光澤。來(lái)源不同的菌株之間致病性喪失的速率有很大差異。研究表明，青枯菌致病性喪失與諸多因素有關(guān)，如菌株來(lái)源，培養(yǎng)基中碳 、氮來(lái)源、種類(lèi)、培養(yǎng)條件等[14]。青枯菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng) ， 易產(chǎn)生無(wú)毒突變體，而在無(wú)菌水中失毒則相對(duì)較慢。分子遺傳學(xué)研究指出，青枯菌的致病性基因主要攜帶在一個(gè)特大質(zhì)粒上，而且分布在 7 個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶片段上 [15]。這可能是該菌易變異的主要原因之一。 Ralstonia solanacearum 可利用多種有機(jī) 碳源 、無(wú)機(jī)碳 源 、氮源，不同來(lái)源的菌株對(duì)不同碳、氮化合物的利用能力有很大差異。自 20 世紀(jì) 60 年代以來(lái)，國(guó)際上對(duì)不同寄主上的青枯 病 菌株的生化型進(jìn)行了研究，澳大利亞的 A C Hayword[16]依據(jù)對(duì) 3 種雙糖 (麥芽糖、纖維二糖、蔗糖 )和 3 種己醇 (甘露醇、甜醇、山梨醇 )的利用能力，將149 個(gè)青枯 病 菌株分為 4 個(gè)生化型。 1986 年，華靜月等 [9,12]又將桑樹(shù)青枯菌株分為新生化型，即生化型 V。煙草青枯菌的生化型變異很大，不同來(lái)源的菌株其生化型有很大差異 [11,17]，而且菌株經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間保存后，其所屬生化型也會(huì)發(fā)生變化 [17]。美國(guó)北卡的煙草青枯菌菌株主要為生化型 Ⅰ [18]，中國(guó)臺(tái)灣省以生化型 Ⅱ 和 Ⅲ 為主 [19]，朝鮮則主要為生化型 Ⅰ 和 Ⅳ [20]。據(jù)報(bào)道，中國(guó)大陸上煙草青枯菌為生化型 Ⅲ 和 Ⅳ [9,12,21]，張建華等 [21]研究了 30 個(gè)煙草青枯病菌株對(duì) 3 種雙糖和 3 種已醇的利用能力，結(jié)果表明，供試青枯菌可分為 2 個(gè)生化型 (Ⅲ 、 Ⅳ )，生化型 Ⅲ 在測(cè)試地區(qū)和品種上均有發(fā)生。王敏等 [22]測(cè)定了 81 個(gè)煙草青枯菌菌株的生化型，結(jié)果表明，云南省以生化型 Ⅲ 為主。在自然或人工培養(yǎng)條件下，青枯菌易產(chǎn)生無(wú)毒突變體，其生化型也發(fā)生變化，在同一個(gè)地區(qū)和同一寄主上可以分離到生化型不同的菌株。張建華等 [21]的研究從同一地區(qū)的同一品種上也分離到兩個(gè)或兩個(gè)以上的生化型。此外，隨著對(duì)煙草青枯菌菌株研究數(shù)量的增多，還出現(xiàn)了越來(lái)越多的 不能歸入現(xiàn)有任何生化型的中間型菌株 [12,2123]。 故有的學(xué)者又提出了生物亞型的概念，但對(duì)生化型與生化型之間的關(guān)系及其劃分標(biāo)準(zhǔn)尚缺蜂膠對(duì)煙草青枯病防治效果的初步研究 6 乏統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。 在自然條件下，病原菌通常是從煙株的根部侵入，而且在根系又傷口的條件下更容易侵入。 Lucas 等 (1975)的研究結(jié)果是煙株根系形成傷口后立即進(jìn)行接種 ， 要比在24h 后再接種的感染率要高得多，在傷根 48h 后再接種 ， 煙株受害率更明顯減少，這說(shuō)明傷口在形成 48h 后已經(jīng)基本愈合，可阻止病原菌入侵。移栽時(shí)造成的傷口也比移栽后造成的傷口更易侵入。病原菌在煙 株其他部位侵入也是通過(guò)傷口進(jìn)行的。但是，在接種細(xì)菌數(shù)量很大的情況下，即使沒(méi)有傷口也能侵入。 青枯 病 菌對(duì)煙株的致病作用大致可以分為三個(gè)過(guò)程，即誘導(dǎo)局部枯萎、破壞組織和整株枯萎。病原菌侵入皮層后于細(xì)胞間隙生長(zhǎng)，破壞細(xì)胞間的中膠層，使細(xì)胞質(zhì)壁分離，變形，并形成空腔，繼而侵染木 質(zhì)部薄壁組織，使導(dǎo)管附近的小細(xì)胞受刺激形成侵填體，并移入侵填體。 侵填體破裂后既被釋放進(jìn)入導(dǎo)管，青枯菌在導(dǎo)管內(nèi)大量繁殖菌體及其代謝產(chǎn)生的大分子物質(zhì) (主要是胞外多糖， EPS)，其影響和阻礙植物體內(nèi)的水分運(yùn)輸， EPS 堵塞導(dǎo)管，并在導(dǎo)管內(nèi)大量增殖和快 速傳播擴(kuò)張，影響和阻礙植物體內(nèi)水分運(yùn)輸，同時(shí)青枯菌還向胞外分泌多種細(xì)胞壁降解酶，破壞導(dǎo)管組織，從而引起植株萎蔫和死亡 [24]。 青枯病菌引起多種植物的致死性枯萎，主要通過(guò)根和莖的傷口 ， 或次生根的根冠進(jìn)入植物體，侵染寄主的木質(zhì)部，然后在整個(gè)維管束中蔓延，引起嚴(yán)重的萎蔫，最終導(dǎo)致植物死亡。青枯菌雖然寄主范圍廣泛，但某些菌系在自然條件下 ， 只能侵染少數(shù)幾種或某一種植物，因此青枯菌的致病機(jī)理十分復(fù)雜。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)青枯菌致病機(jī)理的研究大量集中在對(duì)胞外多糖 (EPS，由 eps 基因編碼 )、果膠酶 (主要為內(nèi)聚半乳糖醛酸酶， PG，由 pgIA 基因編碼 )和纖維素酶 (主要為內(nèi)切葡聚糖酶 EG，由 egl 基因編碼 )在致病過(guò)程中的作用 [24]。青枯病菌在導(dǎo)管中生長(zhǎng)時(shí)可產(chǎn)生大量胞外多糖，影響和阻塞植物內(nèi)的水分運(yùn)輸，特別是易于對(duì)葉柄結(jié)和小葉處較小孔徑的導(dǎo)管穿孔板造成堵塞，因而引起植株萎蔫 [25]。 20 世紀(jì) 80 年代中期以來(lái)，已從分子水平上來(lái)研究這些因素的作用。美國(guó)威斯康星大學(xué) Sequeira 實(shí)驗(yàn)室在多年研究胞外多糖的基礎(chǔ)上，于 1991年報(bào)道克隆出了控制胞外多糖和脂多糖的基因簇，佐治亞大學(xué) Denny 實(shí)驗(yàn)室克隆出了控制胞外多糖等表型轉(zhuǎn)變的基因，美國(guó)的 Schell 等和 Allen 等已在分子水平上進(jìn)行了研究，對(duì)聚半乳糖醛酸酶的結(jié)構(gòu)基因及內(nèi)葡聚糖酶的結(jié)構(gòu)基因均已進(jìn)行了克隆、測(cè)序和功能分析。結(jié)論是這兩種酶在青枯菌致病中有一定作用 [26]。此外，在該菌中被鑒定出 hrp 基因在寄主和病原菌互作中起到重要作用，引起寄主發(fā)病 [26]。 蜂膠對(duì)煙草青枯病防治效果的初步研究 7 由于各地地理環(huán)境和氣候條件不同， 青枯病在各地區(qū)的發(fā)生消長(zhǎng)態(tài)勢(shì)存 在很大差異。了解病區(qū)煙草青枯病的侵染與發(fā)病動(dòng)態(tài)，對(duì)病害早期監(jiān)測(cè)，以及 藥劑防治適宜時(shí)期的確定具有重要的 指導(dǎo)意義。有關(guān)根部侵染的早期監(jiān)測(cè)研究很少， 陳順輝等提出通過(guò) 20cm 土溫和高感品種紅花大金元的萎蔫癥狀監(jiān)測(cè)煙草青枯病的流行動(dòng)態(tài) [27]。 青枯病在我國(guó)呈由北向南、由西向東始病期逐漸提早 ， 為害程度逐漸加重的趨勢(shì) [28]。煙草青枯病發(fā)生危害與品種、耕作類(lèi)型、栽培管理、地形地勢(shì)等有密切關(guān)系 [29]。據(jù)廣東省的調(diào)查結(jié)果表明，在春季 5 月份日均氣溫達(dá)到 23℃ 以上開(kāi)始出現(xiàn)煙草青枯病病株；當(dāng)旬降水 50cm 以下，相對(duì)濕度 80%以下，日照率高于 15%，青枯病輕度發(fā)生； 當(dāng)日均氣溫為 25～ 30℃ ，多雨、高溫、少日照條件下病害則嚴(yán)重流行。病原菌從根部侵入 后 1 周或稍長(zhǎng)時(shí)間，煙株地上部出現(xiàn)青枯癥 狀。發(fā)病后 25d 內(nèi)病情發(fā)展快，以后病情逐漸減弱 [28]。同一省區(qū)平原與山區(qū)發(fā)病時(shí)期也不同，山區(qū)比平原發(fā)病稍晚一些 [30]。 煙草青枯病是高溫高濕型病害。低溫高濕或高溫干旱都不能使病害發(fā)生和流行。發(fā)病最適宜的溫度為 30～ 35℃ 。濕度是影響該病發(fā)病流行的另一重要因素。雨量多、濕度大，病害發(fā)展快，為害重，相反雨量少、濕度低，病害發(fā)展受抑制，為害相對(duì)較輕。暴風(fēng)雨或久旱后遇暴風(fēng)雨或時(shí)雨時(shí)晴的悶熱天氣 ， 更有利于病害的發(fā)生和流行，往往易于造成該病的大發(fā)生 [1]。不同土壤類(lèi)型 ，青枯病的發(fā)病程度差異較 大。 土質(zhì)粘重易板結(jié)或土壤含沙量過(guò)高都易誘發(fā)病害。一般情況下，水田煙發(fā)病較輕，旱地?zé)煱l(fā)病較重，砂壤土發(fā)病較輕。通常地勢(shì)高的煙地發(fā)病較輕，地勢(shì)低的煙地發(fā)病較重，低洼積水處更重，田塊的入水口或流水經(jīng)過(guò)處也較重。 青枯病菌主要在土壤中及遺落在土壤中的病殘?bào)w上越冬，也能在各種生長(zhǎng)著的寄主體內(nèi)及根際越冬。種子一般是不帶菌的。因此，青枯病菌的主要初侵染源是土壤、病殘?bào)w和肥料。病菌靠流水、肥料、病苗、人、畜及生產(chǎn)工具帶菌傳播。人工操作和昆蟲(chóng)為害常使該病傳播和入侵同時(shí)完成。在諸多因素中，帶菌土壤是最重要的初侵染源。橋本光司 (1986)對(duì)不