westernblotting技術(shù)實(shí)驗(yàn)室專用(編輯修改稿)
2025-02-03 12:36 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 APS以及 2 μl的 TEMED，輕輕混勻，緩慢注入兩玻璃板之間分離膠的上方，加滿，插入梳子。室溫放置待其凝固。 B. 蛋白樣本制備 取 20~100 μg的總蛋白，加入同樣體積的 2蛋白上樣緩沖液，于沸水中煮 5 min，然后 6000 rmp、 2 min，取上清待用。 C. 電泳 a) 把做好的濃縮 分離膠板放入電泳裝置中，加入 1蛋白電泳緩沖液，輕輕拔出梳子。 b) 把蛋白樣本加入加樣孔。 c) 電泳：濃縮膠 70 V，分離膠 140 V，直至溴酚藍(lán)遷移至底部，停止電泳。 D. 電轉(zhuǎn)膜 a) 準(zhǔn)備好與膠大小一致的硝酸纖維素膜一張、兩張相應(yīng)大小的濾紙，將其與纖維墊放入 1蛋白轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡 15~60 min。 b) 按照纖維墊、濾紙、膠、膜、濾紙、纖維墊的順序作好轉(zhuǎn)膜三明治，濾紙、膠 、膜、濾紙各層中要用玻棒趕盡氣泡，然后放入轉(zhuǎn)膜裝置中。 注意放置的次序：負(fù)極（黑孔板） — → 纖維墊 — → 濾紙 — → 膠 — → 膜— → 濾紙 — → 纖維墊 — → 正極（紅孔板）。 c) 于 4℃ 、 100 V轉(zhuǎn)膜 1~2 h。 d) 轉(zhuǎn)膜完畢后，取出膜，放入麗春紅染液中染色 5 min，觀察轉(zhuǎn)膜效果。 e) 將膜于清水中沖洗，洗去麗春紅，放入 PBS，待用。 E. 封閉 將膜放入 5%脫脂奶粉（ PBS配制）中，于脫色搖床中室溫緩慢搖 1 h。 F. 雜交 a) 用 PBS或是封閉液稀釋一抗： RabbitantiDnaic2（
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