age電泳基礎word版(編輯修改稿)
2025-02-02 02:06 本頁面
【文章內容簡介】 后，要在沸水浴中煮 3～ 5 min，使 SDS 與蛋白質充分結合，以使蛋白質完全變性和解聚，并形成棒狀結構。 SDS 與蛋白質結合后使蛋白質－ SDS 復合物上帶有大量的負電荷，平均每兩個氨基酸殘基結合一個 SDS 分子 ，這時各種蛋白質分子本身的電荷完全被 SDS 掩蓋。這樣就消除了各種蛋白質本身電荷上的差異。樣品處理液中通常還加入溴酚藍染料，用于控制電泳過程。另外樣品處理液中也可加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時樣品溶液可以沉入樣品凹槽底部。 制備凝膠時首先要 根據(jù)待分離樣品的情況選擇適當?shù)姆蛛x膠濃度 ，例如通常使用的 15％的聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍是 104～ 105，即分子量小于 104 的蛋白質可以不受孔徑的阻礙而通過凝膠，而分子量大于 105的蛋白質則難以通過凝膠孔徑，這兩種情況的蛋白質都不能得到分離。所以如果要分離較大的蛋白質，需要使用 低濃度如 10％或 %的凝膠 (孔徑較大 )；而對于分離較小的蛋白質，使用的較高濃度凝膠 (孔徑較小 )可以得到更好的分離效果。分離膠聚合后，通常在上面加上一層濃縮膠 (約 1cm)，并在濃縮膠上插入樣品梳，形成上樣凹槽。 濃縮膠是低濃度的聚丙烯 酰胺凝膠 ，由于濃縮膠具有較大的孔徑 (丙烯酰胺濃度通常為 3～ 5％ )，各種蛋白質都可以不受凝膠孔徑阻礙而自由通過。 濃縮膠通常 pH 值較低 (通常pH = )，用于樣品進入分離膠前將樣品濃縮成很窄的區(qū)帶。濃縮膠聚合后取出樣品梳，上樣后即可通電開始電泳。 聚丙烯酰胺凝膠電泳和 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳有兩種系統(tǒng)，即 只有分離膠的連續(xù)系統(tǒng)和有濃縮膠與分離膠的不連續(xù)系統(tǒng) ，不連續(xù)系統(tǒng)中最典型、國內外均廣泛使用的是著名的OrnsteinDavis 高 pH 堿性不連續(xù)系統(tǒng)，其濃縮膠丙烯酰胺濃度為 4％， pH = ， 分離膠的丙烯酰胺濃度為 ％， pH =。電極緩沖液的 pH = ，用 Tris、 SDS 和甘氨酸配制。配膠的緩沖液用 Tris、 SDS 和 HCl 配制。 樣品在電泳過程中首先通過濃縮膠，在進入分離膠前由于等速電泳現(xiàn)象而被濃縮。這是由于在電泳緩沖液中主要存在三種陰離子， CL－、甘氨酸陰離子以及蛋白質－ SDS 復合物，在濃縮膠的 pH 值下，甘氨酸只有少量的電離，所以其電泳遷移率最小，而 CL－的電泳遷移率最大。在電場的作用下， CL－最初的遷移速度最快，這樣在 CL－后面形成低離子濃度區(qū)域，即低電導區(qū)，而 低電導區(qū)會產生較高的電場強度，因此 CL－后面的離子在較高的電場強度作用下會加速移動。達到穩(wěn)定狀態(tài)后， CL－和甘氨酸之間形成穩(wěn)定移動的界面。而蛋白質－ SDS 復合物由于相對量較少，聚集在甘氨酸和 Cl－的界面附近而被濃縮成很窄的區(qū)帶(可以被濃縮三百倍 )， 所以在濃縮膠中 CL－是快離子 (前導離子 )，甘氨酸是慢離子 (尾隨離子 )。 當甘氨酸到達分離膠后，由于分離膠的 pH 值 (通常 pH = )較大，甘氨酸離解度加大，電泳遷移速度變大超過蛋白質－ SDS 復合物，甘氨酸和 Cl－的界面很快超過蛋白質－ SDS 復合物。這 時 蛋白質－ SDS 復合物 在分離膠中以本身的電泳遷移速度進行電泳， 向正極移動 。由于蛋白質－ SDS 復合物
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