醫(yī)學高級職稱論ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-01 07:53 本頁面
【文章內容簡介】 ,72 ℃ 延伸 30 s，循環(huán) 30次，最后 72 ℃ 延伸 5 min,4 ℃保溫。擴增片段經 20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 免疫組化方法檢測 TFPI2蛋白的表達 取對數生長期細胞，按 5 104/mL的密度接種于經預處理的蓋玻片上，待細胞貼壁后加藥 (分組同 RTPCR)。培養(yǎng) 48 h后加入 40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min,30 mL/L H2O2封閉內源性過氧化物酶，室溫下 10 min,100 mL/L動物血清封閉，室溫下 10 min，滴加 1∶ 100的稀釋的 TFPI2抗體 4 ℃ 過夜，二抗室溫下 1 h，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素， 37 ℃ 孵育 30 min， DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明封片。另取爬片滴加 PBS 液代替一抗作為陰性對照。結果判定： TFPI2蛋白陽性信號均呈棕黃色顆粒樣物質，位于細胞質內。光鏡下隨機選取 10個視野 (每個視野觀察細胞數不少于 100個 )，按陽性細胞所占百分比進行結果判定。陽性率 =(陽性細胞數 /1 000) 100%。 統(tǒng)計學處理 應用 。實驗數據采用均數 177。 標準差 (x177。 s)表示，采用單因素方差分析加 LSD兩兩比較法進行分析。檢驗水準 α=。 2 結 果 干預前后細胞增長率的變化 經 MTT檢測，結果顯示，實驗組細胞抑制率明顯高于未加藥組，且隨著作用時間的延長和濃度的增加而增加 (表 1)。表 1 不同濃度的 5azaCdR對Eca9706細胞增殖的影響 干預前后細胞凋亡率的變化 流式細胞儀分析可見，經不同濃度 5AzaCdR誘導 48 h后， Eca9706細胞各處理組凋亡率分別為 (177。 )%、 (177。 )%、 (177。 )%，與 5AzaCdR誘導濃度成正比。與對照組 [(177。 )%]比較差異有統(tǒng)計學意義 (P)，且各濃度組間比較差異亦有統(tǒng)計學意義 (P，圖 1)。以上實驗重復 5次。 干預前后 Eca9706細胞 mRNA的表達情況 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示， Eca9706細胞中 TFPI2 mRNA表達在各用藥組和未用藥組之間有明顯差異， TFPI2 mRNA在未用藥組細胞中未見表達。經 、 、 μmol/L 5AzaCdR處理后可見 TFPI2 mRNA表達，表明在一定范圍內隨 5AzaCdR藥物濃度的增加 TFPI2 mRNA表達逐漸增強 (圖 2)。圖 1 各組流式細胞凋亡散點圖 A：對照組 。B： μmol/L 5AzaCdR組 。C： μmol/L 5AzaCdR組 。D： μmol/L 5AzaCdR組。圖 2 5AzaCdR處理前后 Eca9706細胞 TFPI2 mRNA的表達 M： DNA marker。βactin： 301 bp。TFPI2： 440 bp。1：對照組 。2： 。3： μmol/L組 。4： μmol/L組 。5： H2O對照組。 , 干預前后 TFPI2蛋白的表達情況 免疫組化結果顯示，經 5AzaCdR作用 Eca9706細胞 48 h， TFPI2蛋白的陽性表達率增加，對照組、 μmol/L組、 μmol/L組、 μmol/L組 TFPI2蛋白的陽性表達率分別為 (177。 )%、(177。 )%、 (177。 )%、 (177。 )%，不同濃度組之間以及用藥組與對照組之間的差異均有統(tǒng)計學意義 (P，圖 3)。 圖 3 各組 TFPI2蛋白的表達情況 3 討 論 人 TFPI2(hTFPI2)基因定位于 7q22
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